黑色素瘤(melanoma)是死亡率極高的皮膚惡性腫瘤,在獸醫(yī)臨床上常見(jiàn)于老齡動(dòng)物,在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。其特點(diǎn)是惡性程度高、進(jìn)展快、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,是一種對(duì)常規(guī)治療藥物具有較強(qiáng)的抗性,在臨床治療過(guò)程中頗為棘手的惡性腫瘤,對(duì)食品衛(wèi)生和公共安全構(gòu)成極大的危害。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,基因治療逐漸顯示出巨大的優(yōu)勢(shì),現(xiàn)已成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。黑色素瘤作為一種淺表性腫瘤,非常適用于基因治療的觀察和研究。實(shí)體瘤中因存在局部免疫抑制、缺氧、血液供應(yīng)不足、壞死區(qū)等,使腫瘤微環(huán)境中形成免疫逃逸現(xiàn)象,導(dǎo)致化療藥物無(wú)法順利到達(dá)并發(fā)揮治療作用,但卻為一系列厭氧菌及兼性厭氧菌提供了有利的生長(zhǎng)環(huán)境。這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示某些細(xì)菌可能成為新型的腫瘤基因治療載體。目前,影響腫瘤基因治療效果的兩大關(guān)鍵因素是治療載體系統(tǒng)和治療基因的選擇。因此,尋找合適的靶向性載體和治療基因是腫瘤基因治療的核心,同時(shí)也是本課題的研究目的及科學(xué)意義所在。腫瘤靶向肽(RGD)是細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞整合素αvβ3之間結(jié)合的強(qiáng)效競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑,常被用作腫瘤靶向標(biāo)記物。蜂毒肽(MEL)是蜂毒中具有藥理作用和生物學(xué)活性的主要組分,在抑制腫...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 減毒沙門(mén)氏菌在腫瘤基因治療中的研究進(jìn)展
        1.1.1 細(xì)菌治療腫瘤的研究背景
        1.1.2 沙門(mén)氏菌載體在腫瘤治療中的研究現(xiàn)狀和問(wèn)題
            1.1.2.1 沙門(mén)氏菌載體在腫瘤治療中的研究現(xiàn)狀
            1.1.2.2 沙門(mén)氏菌載體在腫瘤治療中的問(wèn)題
    1.2 腫瘤靶向肽在腫瘤治療中的作用機(jī)制和研究進(jìn)展
        1.2.1 RGD靶向腫瘤的作用機(jī)制
        1.2.2 RGD治療腫瘤的研究進(jìn)展
    1.3 蜂毒肽的抑瘤機(jī)制及研究進(jìn)展
        1.3.1 蜂毒肽作為藥物的研究背景
        1.3.2 蜂毒肽的抑瘤活性及存在問(wèn)題
    1.4 研究方案
        1.4.1 技術(shù)路線
        1.4.2 研究?jī)?nèi)容和意義
第二章 表達(dá)RGD及MEL雙基因減毒沙門(mén)氏菌的制備
    第一節(jié) 表達(dá)RGD及MEL雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1 材料與方法
            2.1.1 材料
                2.1.1.1 菌株、細(xì)胞系和載體
                2.1.1.2 試劑
                2.1.1.3 主要儀器
                2.1.1.4 溶液和培養(yǎng)基
            2.1.2 方法
                2.1.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
                2.1.2.2 引物設(shè)計(jì)
                2.1.2.3 重組質(zhì)粒p MD-RGD-MEL和pMD-MEL的提取
                2.1.2.4 pEGFP-N1和p MD-RGD-MEL、pMD-MEL的雙酶切
                2.1.2.5 產(chǎn)物回收
                2.1.2.6 質(zhì)粒的制備與鑒定
                2.1.2.7 重組質(zhì)粒圖譜
        2.2 結(jié)果與分析
            2.2.1 RGD-MEL及MEL基因擴(kuò)增
            2.2.2 pEGFP-RGD-MEL重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            2.2.3 pEGFP-MEL重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        2.3 討論
        2.4 小結(jié)
    第二節(jié) 重組減毒沙門(mén)氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL的制備及穩(wěn)定性檢測(cè)
        2.5 材料與方法
            2.5.1 材料
                2.5.1.1 菌株、細(xì)胞系和載體
                2.5.1.2 主要試劑
                2.5.1.3 主要儀器
            2.5.2 方法
                2.5.2.1 重組減毒沙門(mén)氏菌LH430感受態(tài)細(xì)胞的制備
                2.5.2.2 重組減毒沙門(mén)氏菌的構(gòu)建與鑒定
                2.5.2.3 重組減毒沙門(mén)氏菌遺傳穩(wěn)定性鑒定
                2.5.2.4 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀記錄LH430/pEGFP-RGD-MEL生長(zhǎng)曲線
                2.5.2.5 B16細(xì)胞的培養(yǎng)
                2.5.2.6 重組減毒沙門(mén)氏菌侵染B16細(xì)胞
                2.5.2.7 重組減毒沙門(mén)氏菌侵染B16細(xì)胞總RNA的提取
                2.5.2.8 RT-PCR檢測(cè)目的基因RGD-MEL和MEL的表達(dá)
                2.5.2.9 Western blotting檢測(cè)
        2.6 結(jié)果與分析
            2.6.1 重組減毒沙門(mén)氏菌的制備與鑒定
            2.6.2 重組減毒沙門(mén)氏菌的穩(wěn)定性
            2.6.3 重組減毒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
            2.6.4 重組減毒沙門(mén)氏菌侵染B16細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果
            2.6.5 RT-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)
            2.6.6 Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果
        2.7 討論
        2.8 小結(jié)
第三章 LH430/pEGFP-RGD-MEL的體外抑瘤作用的研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
            3.1.1.1 菌株、細(xì)胞系和載體
            3.1.1.2 主要試劑
            3.1.1.3 主要儀器
        3.1.2 方法
            3.1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.1.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染細(xì)胞
            3.1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)LH430/pEGFP-RGD-MEL對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響
            3.1.2.4 Western blotting檢測(cè)B16細(xì)胞中凋亡蛋白
            3.1.2.5 掃描電鏡觀察
            3.1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B16細(xì)胞凋亡情況
            3.1.2.7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)B16細(xì)胞遷移能力
            3.1.2.8 細(xì)胞趨化試驗(yàn)檢測(cè)FBS介導(dǎo)B16細(xì)胞的遷移能力
            3.1.2.9 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)檢測(cè)B16細(xì)胞的侵襲能力
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 LH430/pEGFP-RGD-MEL抑制腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞增殖作用的測(cè)定
        3.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的IC50值
        3.2.3 LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染B16細(xì)胞中凋亡蛋白的表達(dá)
        3.2.4 掃描電鏡觀察LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染B16細(xì)胞表面形態(tài)變化
        3.2.5 LH430/pEGFP-RGD-MEL對(duì)B16細(xì)胞的凋亡作用
        3.2.6 LH430/pEGFP-RGD-MEL抑制B16細(xì)胞遷移情況
        3.2.7 LH430/pEGFP-RGD-MEL可抑制FBS介導(dǎo)的B16細(xì)胞遷移
        3.2.8 LH430/pEGFP-RGD-MEL可抑制B16細(xì)胞的侵襲能力
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 小鼠黑色素瘤模型的構(gòu)建
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
            4.1.1.1 細(xì)胞系和試驗(yàn)動(dòng)物
            4.1.1.2 主要試劑
            4.1.1.3 主要儀器
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 B16實(shí)體瘤模型的建立與荷瘤小鼠的治療
            4.1.2.2 荷瘤小鼠活體成像
            4.1.2.3 Q-PCR檢測(cè)RGD-MEL基因在各組織中的表達(dá)
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 荷瘤小鼠生存曲線及體重變化曲線
        4.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL對(duì)荷瘤小鼠內(nèi)臟器官及腫瘤重量的影響
        4.2.3 小鼠活體成像結(jié)果
        4.2.4 Q-PCR檢測(cè)各組織MEL基因表達(dá)量
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 小鼠黑色素瘤模型的病理學(xué)檢測(cè)
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
            5.1.1.1 試驗(yàn)組織
            5.1.1.2 主要試劑
            5.1.1.3 主要儀器
            5.1.1.4 試驗(yàn)試劑
        5.1.2 方法
            5.1.2.1 冰凍切片的制備
            5.1.2.2 病理切片的制備及HE染色
            5.1.2.3 免疫組織化學(xué)染色
            5.1.2.4 TUNEL法染色
            5.1.2.5 腫瘤組織細(xì)菌計(jì)數(shù)
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 腫瘤組織冰凍切片結(jié)果
        5.2.2 各組織HE染色結(jié)果
        5.2.3 各腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
        5.2.4 TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞凋亡狀況
        5.2.5 腫瘤組織中細(xì)菌殘留狀況
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
第六章 RNA-seq研究LH430/pEGFP-RGD-MEL抑瘤機(jī)理
    6.1 材料與方法
        6.1.1 材料
            6.1.1.1 試驗(yàn)組織
            6.1.1.2 主要試劑
            6.1.1.3 主要儀器
        6.1.2 方法
            6.1.2.1 腫瘤組織中RNA提取
            6.1.2.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)
            6.1.2.3 RNA文庫(kù)構(gòu)建
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 測(cè)序組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)
        6.2.2 差異基因富集功能分析
        6.2.3 差異基因的KEGG代謝通路結(jié)果分析
        6.2.4 深入分析結(jié)果
    6.3 討論
    6.4 小結(jié)
結(jié)論
論文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄一 序列信息
附錄二 測(cè)序報(bào)告
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號(hào)：3755424