眾所周知,Bcl-xl,Bax2和NF-κB參與抗凋亡反應(yīng)。盡管在一些魚中已經(jīng)報道了Bcl-xl,但NF-κB介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制和細(xì)胞抗凋亡功能仍不清楚。本實驗我們克隆了草魚(Ctenopharyngodon idella)Bcl-xl(CiBcl-xl)的全長cDNA序列及其啟動子序列。CiBcl-xl的全長cDNA為2836bp,ORF為627bp,編碼208個氨基酸的多肽。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示CiBcl-xl與Dario rerio Bcl-xl(Dr Bcl-xl)具有高度同源性。在用poly I:C刺激后,CIK細(xì)胞和各組織中CiBcl-xl的表達(dá)顯著上調(diào),這說明CiBcl-xl在抗病毒免疫機(jī)制中有重要作用。之后為了進(jìn)一步理解NF-κB對Bcl-xl的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,在大腸桿菌BL21中大量表達(dá)CiC-rel和Cip65,并通過Ni-NTA His-Bind樹脂的親和層析純化。在體外,凝膠阻滯實驗分析證明了CiC-rel和Cip65與CiBcl-xl啟動子的高親和力。雙熒光素酶報告基因檢測顯示CiC-rel和Cip65都能激活CiBcl-xl啟動子。因此,與哺乳動物類似,魚類C-rel和...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 Bcl-2 家族
    1.2 Bcl-xl的結(jié)構(gòu)及其功能
    1.3 Bcl-xl信號傳導(dǎo)通路
        1.3.1 Bcl-xl轉(zhuǎn)錄水平
        1.3.2 Bcl-xl蛋白水平
    1.4 Bcl-xl的研究進(jìn)展
    1.5 研究的目的與意義
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細(xì)胞株、載體與菌種
        2.1.2 實驗儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑和試劑盒
        2.1.4 引物表
        2.1.5 相關(guān)軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 草魚Bcl-xl全長c DNA的克隆
        2.2.2 草魚Bcl-xl啟動子的克隆
        2.2.3 草魚Bcl-xl的系統(tǒng)進(jìn)化分析
    2.3 草魚Bcl-xl在 CIK細(xì)胞中與組織中的表達(dá)水平分析
        2.3.1 草魚Bcl-xl在組織中的表達(dá)分析
        2.3.2 草魚Bcl-xl在 CIK細(xì)胞中的表達(dá)分析
    2.4 草魚C-rel、p65 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白純化
        2.4.1 原核表達(dá)載體
        2.4.2 小量誘導(dǎo)
        2.4.3 大量表達(dá)及蛋白純化
    2.5 草魚Bcl-xl真核表達(dá)載體構(gòu)建
    2.6 草魚C-rel、p65與Bcl-xl啟動子序列的親和性分析
    2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶分析
        2.7.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.7.2 熒光素酶活性檢測
    2.8 草魚腎細(xì)胞(CIK)C-rel、p65 的敲降(knock-down)
        2.8.1 Ci C-rel、Cip65的siRNA設(shè)計
        2.8.2 siRNA片段轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞
        2.8.3 草魚C-rel、p65 敲降后Bcl-xl的轉(zhuǎn)錄水平檢測
    2.9 細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡檢測
        2.9.1 細(xì)胞活力測定
        2.9.2 細(xì)胞凋亡檢測
    2.10 GST-pull down實驗
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 草魚Bcl-xl的克隆及其分析
        3.1.1 草魚Bcl-xl全長c DNA的克隆
        3.1.2 草魚Bcl-xl基因測序結(jié)果分析
        3.1.3 草魚Bcl-xl基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析
    3.2 草魚Bcl-xl啟動子的克隆及其分析
    3.3 草魚Bcl-xl基因的定量表達(dá)分析
    3.4 草魚C-rel、p65與Bcl-xl的啟動子親和性分析
    3.5 草魚Bcl-xl的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
        3.5.1 檢測草魚Bcl-xl啟動子活性
        3.5.2 草魚C-rel、p65對Bcl-xl基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
    3.6 草魚C-rel、p65 敲降后Bcl-xl的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析
    3.7 過表達(dá)Ci Bcl-xl能增加細(xì)胞活力并抑制細(xì)胞凋亡
    3.8 Ci Bcl-xl-FLAG標(biāo)簽的檢測及Ci Bcl-xl和 Ci Bax2 的相互作用
第四章 討論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文



本文編號：3736372