瘧疾（malaria）是由頂復(fù)亞門瘧原蟲（plasmodium）感染造成的,是一種經(jīng)血液傳播的劣性傳染性疾病,與結(jié)核、艾滋病共同被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為世界傳染性疾病。盡管全球公共衛(wèi)生條件不斷地改善,但目前全世界每年依然有數(shù)億瘧疾感染病例和數(shù)十萬死亡病例。因此,認(rèn)識瘧原蟲,消除瘧疾是一個迫切需要解決的重大課題。迄今為止,CRISPR/Cas9是瘧原蟲基因功能研究中最為高效的修飾工具。但由于瘧原蟲有限的耐藥篩選標(biāo)記,使得研究者需要將所有的修飾元件整合到一個載體上,這就造成了載體容量過大;加之瘧原蟲紅細(xì)胞胞內(nèi)寄生的屬性,電擊轉(zhuǎn)染的載體需要依次穿過四層膜結(jié)構(gòu)才能到達(dá)瘧原蟲的細(xì)胞核;載體容量過大和復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)均限制了電擊轉(zhuǎn)染的效率。為了平衡載體大小和電擊轉(zhuǎn)染效率的關(guān)系,我們將修飾元件中長約4.5kb的Sp.Cas9進行了內(nèi)源基因座位的整合,從而將載體大小縮減為原來的一半;同時我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源整合表達(dá)Sp.Cas9的蟲株可以實現(xiàn)Cas9的轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白的細(xì)胞核定位;此外表達(dá)Sp.Cas9細(xì)胞的陽性率接近100%,顯著高于質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的效率（約50%）。為了驗證該蟲株進行基因修飾的可行性,我們分別選擇了... 

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１．１－Ａ）??

3.1.B兩個山eral獨立克隆的PCR鑒定

圖２．１．３．１－Ａ約氏瘧原蟲Ａｓｅｒａｉ載體的示意圖??


本文編號：3729181