發(fā)布時(shí)間：2022-11-12 10:56

　　【目的】將一種可以高選擇性水解R-甲霜靈的新脂酶基因,在大腸桿菌中進(jìn)行克隆和表達(dá),并研究重組脂酶的性質(zhì)�！痉椒ā扛鶕�(jù)已知的目標(biāo)酯酶N端10個(gè)氨基酸序列,在已測(cè)序的Albibacters sp.zjut528基因組中找到相匹配的一個(gè)酯酶基因,它全長(zhǎng)969bp,編碼322個(gè)氨基酸,將該基因命名為RMest。通過(guò)引物擴(kuò)增得到該基因的DNA片段,將它與表達(dá)載體pET-28a（+）連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21Gold（DE3）,構(gòu)建重組菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)該酯酶,并用Ni²⁺親和層析介質(zhì)進(jìn)行純化�！窘Y(jié)果】在重組菌RMest-pET-28a （+）-E. coli BL21 Gold （DE3）中成功表達(dá)了重組酯酶RMesterase,大小約為46 kDa。用胞內(nèi)重組酶液催化水解R,S-甲霜靈,底物濃度10 g/L,反應(yīng)6 h,底物轉(zhuǎn)化率為49.8%,產(chǎn)物（甲霜靈酸）的ee_p為99.3%,對(duì)底物的對(duì)映體R-構(gòu)型具有專一（選擇）性。該酶最適溫度和pH分別為40℃和pH 9.0。該酶的活性受到產(chǎn)物甲醇的抑制。通過(guò)Blast+在Uniprot KB數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋... 

【文章頁(yè)數(shù)】：13 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 試劑：
        1.1.2 培養(yǎng)基：
    1.2 甲霜靈的分析方法
    1.3 酯酶基因的擴(kuò)增和重組菌的構(gòu)建
    1.4 酯酶基因RMest的表達(dá)和SDS-PAGE分析
    1.5 重組蛋白的純化
    1.6 重組酶RMesterase的酶學(xué)性質(zhì)
        1.6.1 酶的立體選擇性：
        1.6.2 溫度和p H對(duì)酶的活性和穩(wěn)定性的影響：
        1.6.3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定：
        1.6.4 甲醇濃度對(duì)酶活的影響：
2 結(jié)果和分析
    2.1 在Albibacters sp.zjut528菌株基因組中尋找目標(biāo)酯酶基因
    2.2 目標(biāo)酯酶基因RMest的克隆和表達(dá)
    2.3 重組蛋白的純化
    2.4 重組酯酶RMesterase的酶學(xué)性質(zhì)
        2.4.1 酶的立體選擇性：
        2.4.2 溫度和p H對(duì)酶活性及穩(wěn)定性的影響：
        2.4.3 甲醇濃度對(duì)酶活性的影響：
        2.4.4 重組酶的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：
    2.5 酯酶RMest與其他蛋白的序列比對(duì)
        2.5.1 酯酶RMest與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他蛋白的氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹的構(gòu)建：
        2.5.2 酯酶RMest與EHest (水解甲霜靈中間體MAP)的氨基酸序列比對(duì)和催化性質(zhì)比較：
3 討論
4 結(jié)論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]生物法拆分外消旋甲霜靈制備R-甲霜靈[J]. 張朝暉,張利坤,陸躍樂(lè).  化工學(xué)報(bào). 2017(11)
[2]不對(duì)稱水解（R,S）-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯新菌種的分離鑒定及酯酶基因的克隆、表達(dá)[J]. 盧亞南,張朝暉,張利坤,陸躍樂(lè).  微生物學(xué)報(bào). 2016(08)
[3](±)-N-（2,6-二甲苯基）-丙氨酸甲酯的脂肪酶酶促水解拆分方法[J]. 黃麗琴,楊紅.  南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2007(04)
[4]酶法拆分（±）-N-（2,6-二甲苯基）-丙氨酸甲酯[J]. 黃麗琴,陳道文,楊紅.  有機(jī)化學(xué). 2005(12)
[5]精甲霜靈與外消旋體甲霜靈對(duì)掘氏疫霉菌的抑菌活性比較[J]. 劉西莉,馬安捷,林吉柏,劉鵬飛.  農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào). 2003(03)

博士論文
[1]脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究[D]. 鄭良玉.吉林大學(xué) 2004

碩士論文
[1]微膠囊法固定脂肪酶及拆分手性胺的研究[D]. 王世輝.吉林大學(xué) 2010
[2]精甲霜靈的合成研究[D]. 王巖.吉林大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3706239