目的:結(jié)直腸癌是目前臨床常見的一種惡性腫瘤,是第三大最常見的導(dǎo)致高死亡率的癌癥。結(jié)直腸癌每年約造成近50萬人死亡,占全球癌癥發(fā)病率的近10%和所有癌癥死亡的8%。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制涉及多種基因,多個因子,多種信號通路,其發(fā)生發(fā)展是多因素相互調(diào)控的結(jié)果發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。microRNA是一種小的非編碼RNA,能夠識別并結(jié)合其目標(biāo)mRNA的部分互補(bǔ)序列,導(dǎo)致mRNA的降解或其翻譯的抑制。越來越多的研究表明,mRNA在不同的癌癥中通常表現(xiàn)為異常表達(dá),因而在腫瘤中發(fā)揮著促癌或者抑癌的作用�，F(xiàn)有研究表明,miR-320a在胃癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常下調(diào),其作為一種腫瘤抑制性miRNA,但是關(guān)于其在結(jié)直腸癌中的研究卻相對很少。因此,鑒定miR-320a對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及下游靶基因鑒定是探索結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的一個重要方向。方法:miR-320a過表達(dá)病毒感染DLD1與SW620兩株結(jié)直腸癌細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況并進(jìn)行qRT-PCR實驗驗證miR-320a過表達(dá)水平。CCK-8實驗驗證結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞克隆形成實驗驗證結(jié)直腸癌細(xì)胞的克隆形成能力、劃痕實驗驗... 

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 結(jié)直腸癌
        1.1.1 結(jié)直腸癌的概況
        1.1.2 結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展及治療方法
        1.1.3 結(jié)直腸癌的危險因素分析
    1.2 Micro RNA與miR -320a的研究進(jìn)展
        1.2.1 micro RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
        1.2.2 miR-320a的研究進(jìn)展
    1.3 Sp1的研究進(jìn)展
        1.3.1 Sp1概況
        1.3.2 Sp1在腫瘤中的研究概況
        1.3.3 Sp1與結(jié)直腸癌
    1.4 MACC1的研究進(jìn)展
    1.5 FOXQ1的研究進(jìn)展
    1.6 本課題的選題依據(jù)、研究方案、研究目的
        1.6.1 選題依據(jù)
        1.6.2 研究方案
        1.6.3 研究目的
第二章實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細(xì)胞系
        2.1.2 實驗試劑及耗材
        2.1.3 主要實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代
            2.2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            2.2.1.2 細(xì)胞傳代
        2.2.2 miR-320a穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建
            2.2.2.1 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.2.2 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的篩選及擴(kuò)增
            2.2.2.3 慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒病毒包裝、濃縮
            2.2.2.4 慢病毒感染細(xì)胞及陽性細(xì)胞的篩選
            2.2.2.5 qRT-PCR驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞miR-320a過表達(dá)情況
        2.2.3 細(xì)胞功能實驗
            2.2.3.1 細(xì)胞增殖實驗
            2.2.3.2 細(xì)胞克隆形成實驗
            2.2.3.3 細(xì)胞遷移實驗
            2.2.3.4 細(xì)胞Transwell侵襲實驗
        2.2.4 免疫印跡（Western Blotting）實驗
            2.2.4.1 細(xì)胞總蛋白提取
            2.2.4.2 BCA法測定蛋白濃度
            2.2.4.3 蛋白免疫印跡測定蛋白表達(dá)情況
        2.2.5 實時熒光定量實驗（qRT-PCR）
            2.2.5.1 RNA提取
            2.2.5.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄
            2.2.5.3 實時熒光定量（qRT-PCR）
        2.2.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證靶基因
            2.2.6.1 雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建
            2.2.6.2 熒光素酶報告基因檢測的操作方法
第三章 實驗結(jié)果
    3.1 第一部分實驗：miR-320a穩(wěn)定過結(jié)直腸癌細(xì)胞系的構(gòu)建
        3.1.1 miR-320a過表達(dá)組質(zhì)粒與NC對照組質(zhì)粒的擴(kuò)增與檢測
        3.1.2 穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建
        3.1.3 Real-time PCR檢測結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞與SW620細(xì)胞穩(wěn)定過表達(dá)miR-320a的表達(dá)情況
    3.2 第二部分實驗：miR-320a穩(wěn)定過表達(dá)對結(jié)直腸癌的生物學(xué)影響
        3.2.1 CCK-8實驗驗證miR-320a穩(wěn)定過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞和SW620細(xì)胞的生長
        3.2.2 克隆形成實驗驗證miR-320a穩(wěn)定過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞和SW620細(xì)胞的克隆形成能力
        3.2.3 細(xì)胞劃痕實驗驗證miR-320a穩(wěn)定過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞和SW620細(xì)胞的遷移能力
        3.2.4 Tranwell入侵實驗驗證miR-320a穩(wěn)定過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞和SW620細(xì)胞的侵襲能力
    3.3 第三部分實驗:miR-320a下游靶基因的鑒定
        3.3.1 相關(guān)蛋白變化及m RNA變化
        3.3.2 熒光素酶報告系統(tǒng)驗證靶基因
第四章 結(jié)果分析與結(jié)論
    4.1 結(jié)果分析
    4.2 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄 A：攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文
    附錄 B：攻讀學(xué)位期間參與科研項目
    附錄 C：縮略表


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]結(jié)直腸癌與膳食纖維相關(guān)飲食因素病例對照研究[J]. 袁平,李文燕,林修全,楊眉,劉星,陳仲武,林仲,陳鐵暉,林永添,王慧.  中國公共衛(wèi)生. 2016(12)
[2]Micro RNA-320 family is downregulated in colorectal adenoma and affects tumor proliferation by targeting CDK6[J]. Toshihiro Tadano,Yoichi Kakuta,Shin Hamada,Yosuke Shimodaira,Masatake Kuroha,Yoko Kawakami,Tomoya Kimura,Hisashi Shiga,Katsuya Endo,Atsushi Masamune,Seiichi Takahashi,Yoshitaka Kinouchi,Tooru Shimosegawa.  World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2016(07)
[3]miRNA-199a-5p通過SP1調(diào)節(jié)ERK5抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的機(jī)制[J]. 翟麗敏,楊碩,李文通.  臨床與實驗病理學(xué)雜志. 2015(09)
[4]Colorectal cancer: From prevention to personalized medicine[J]. Gemma Binefa,Francisco Rodríguez-Moranta,àlex Teule,Manuel Medina-Hayas.  World Journal of Gastroenterology. 2014(22)
[5]microRNA與腫瘤關(guān)系的研究[J]. 馮瓊,雷章,盧宏達(dá).  中華臨床醫(yī)師雜志(電子版). 2012(15)



本文編號：3706155