目的:結直腸癌是目前臨床常見的一種惡性腫瘤,是第三大最常見的導致高死亡率的癌癥。結直腸癌每年約造成近50萬人死亡,占全球癌癥發(fā)病率的近10%和所有癌癥死亡的8%。結直腸癌的發(fā)病機制涉及多種基因,多個因子,多種信號通路,其發(fā)生發(fā)展是多因素相互調控的結果發(fā)病機制十分復雜。microRNA是一種小的非編碼RNA,能夠識別并結合其目標mRNA的部分互補序列,導致mRNA的降解或其翻譯的抑制。越來越多的研究表明,mRNA在不同的癌癥中通常表現(xiàn)為異常表達,因而在腫瘤中發(fā)揮著促癌或者抑癌的作用�，F(xiàn)有研究表明,miR-320a在胃癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤中表達異常下調,其作為一種腫瘤抑制性miRNA,但是關于其在結直腸癌中的研究卻相對很少。因此,鑒定miR-320a對結直腸癌細胞生物學行為的影響及下游靶基因鑒定是探索結直腸癌發(fā)病機制的一個重要方向。方法:miR-320a過表達病毒感染DLD1與SW620兩株結直腸癌細胞,熒光顯微鏡觀察熒光表達情況并進行qRT-PCR實驗驗證miR-320a過表達水平。CCK-8實驗驗證結直腸癌細胞的增殖能力、細胞克隆形成實驗驗證結直腸癌細胞的克隆形成能力、劃痕實驗驗... 

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 結直腸癌
        1.1.1 結直腸癌的概況
        1.1.2 結直腸癌的研究進展及治療方法
        1.1.3 結直腸癌的危險因素分析
    1.2 Micro RNA與miR -320a的研究進展
        1.2.1 micro RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
        1.2.2 miR-320a的研究進展
    1.3 Sp1的研究進展
        1.3.1 Sp1概況
        1.3.2 Sp1在腫瘤中的研究概況
        1.3.3 Sp1與結直腸癌
    1.4 MACC1的研究進展
    1.5 FOXQ1的研究進展
    1.6 本課題的選題依據(jù)、研究方案、研究目的
        1.6.1 選題依據(jù)
        1.6.2 研究方案
        1.6.3 研究目的
第二章實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞系
        2.1.2 實驗試劑及耗材
        2.1.3 主要實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞復蘇、傳代
            2.2.1.1 細胞復蘇
            2.2.1.2 細胞傳代
        2.2.2 miR-320a穩(wěn)定過表達細胞株的構建
            2.2.2.1 慢病毒表達載體的構建
            2.2.2.2 慢病毒表達質粒的篩選及擴增
            2.2.2.3 慢病毒表達載體質粒病毒包裝、濃縮
            2.2.2.4 慢病毒感染細胞及陽性細胞的篩選
            2.2.2.5 qRT-PCR驗證穩(wěn)轉細胞miR-320a過表達情況
        2.2.3 細胞功能實驗
            2.2.3.1 細胞增殖實驗
            2.2.3.2 細胞克隆形成實驗
            2.2.3.3 細胞遷移實驗
            2.2.3.4 細胞Transwell侵襲實驗
        2.2.4 免疫印跡（Western Blotting）實驗
            2.2.4.1 細胞總蛋白提取
            2.2.4.2 BCA法測定蛋白濃度
            2.2.4.3 蛋白免疫印跡測定蛋白表達情況
        2.2.5 實時熒光定量實驗（qRT-PCR）
            2.2.5.1 RNA提取
            2.2.5.2 RNA逆轉錄
            2.2.5.3 實時熒光定量（qRT-PCR）
        2.2.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證靶基因
            2.2.6.1 雙熒光素酶報告基因載體構建
            2.2.6.2 熒光素酶報告基因檢測的操作方法
第三章 實驗結果
    3.1 第一部分實驗：miR-320a穩(wěn)定過結直腸癌細胞系的構建
        3.1.1 miR-320a過表達組質粒與NC對照組質粒的擴增與檢測
        3.1.2 穩(wěn)定過表達細胞系的構建
        3.1.3 Real-time PCR檢測結直腸癌DLD1細胞與SW620細胞穩(wěn)定過表達miR-320a的表達情況
    3.2 第二部分實驗：miR-320a穩(wěn)定過表達對結直腸癌的生物學影響
        3.2.1 CCK-8實驗驗證miR-320a穩(wěn)定過表達抑制結直腸癌DLD1細胞和SW620細胞的生長
        3.2.2 克隆形成實驗驗證miR-320a穩(wěn)定過表達抑制結直腸癌DLD1細胞和SW620細胞的克隆形成能力
        3.2.3 細胞劃痕實驗驗證miR-320a穩(wěn)定過表達抑制結直腸癌DLD1細胞和SW620細胞的遷移能力
        3.2.4 Tranwell入侵實驗驗證miR-320a穩(wěn)定過表達抑制結直腸癌DLD1細胞和SW620細胞的侵襲能力
    3.3 第三部分實驗:miR-320a下游靶基因的鑒定
        3.3.1 相關蛋白變化及m RNA變化
        3.3.2 熒光素酶報告系統(tǒng)驗證靶基因
第四章 結果分析與結論
    4.1 結果分析
    4.2 結論
致謝
參考文獻
附錄
    附錄 A：攻讀學位期間發(fā)表論文
    附錄 B：攻讀學位期間參與科研項目
    附錄 C：縮略表


【參考文獻】：
期刊論文
[1]結直腸癌與膳食纖維相關飲食因素病例對照研究[J]. 袁平,李文燕,林修全,楊眉,劉星,陳仲武,林仲,陳鐵暉,林永添,王慧.  中國公共衛(wèi)生. 2016(12)
[2]Micro RNA-320 family is downregulated in colorectal adenoma and affects tumor proliferation by targeting CDK6[J]. Toshihiro Tadano,Yoichi Kakuta,Shin Hamada,Yosuke Shimodaira,Masatake Kuroha,Yoko Kawakami,Tomoya Kimura,Hisashi Shiga,Katsuya Endo,Atsushi Masamune,Seiichi Takahashi,Yoshitaka Kinouchi,Tooru Shimosegawa.  World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2016(07)
[3]miRNA-199a-5p通過SP1調節(jié)ERK5抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲的機制[J]. 翟麗敏,楊碩,李文通.  臨床與實驗病理學雜志. 2015(09)
[4]Colorectal cancer: From prevention to personalized medicine[J]. Gemma Binefa,Francisco Rodríguez-Moranta,àlex Teule,Manuel Medina-Hayas.  World Journal of Gastroenterology. 2014(22)
[5]microRNA與腫瘤關系的研究[J]. 馮瓊,雷章,盧宏達.  中華臨床醫(yī)師雜志(電子版). 2012(15)



本文編號：3706155