本文關(guān)鍵詞：甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：低溫、干旱和鹽堿是植物的生長(zhǎng)過程中常見的非生物逆境。為了應(yīng)對(duì)這些脅迫,植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套自我保護(hù)的逆境信號(hào)傳導(dǎo)和應(yīng)答機(jī)制,其中包括細(xì)胞內(nèi)第二信使——Ca2+信號(hào)介導(dǎo)的信號(hào)傳遞機(jī)制。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B類似蛋白(Calcineurin B-like protein, CBL)與下游鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B類似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)相互作用,共同形成了植物應(yīng)答逆境脅迫的CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)。目前對(duì)于CBL-CIPK的研究主要集中在擬南芥和水稻上,在其他植物的研究也相應(yīng)展開,但在甘蔗中研究甚少。因此,克隆甘蔗CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)中的CBL和CIPK基因并進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證,對(duì)解析甘蔗抗逆機(jī)制具有較為重要的理論和實(shí)踐意義。本研究在NCBI數(shù)據(jù)庫和實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫中,查找和分析獲得甘蔗ScCBL和ScCIPK基因相關(guān)的EST序列和Unigene序列；然后,利用電子克隆結(jié)合RT-PCR (Reversetranscription-PCR)技術(shù),成功獲得4個(gè)ScCBLs基因和10個(gè)ScCIPKs基因序列并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；其次,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)技術(shù),分析這些基因在甘蔗中的組織特異性表達(dá)情況及其在不同外源脅迫下的表達(dá)特性；最后,通過雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)研究了ScCBL2和ScCIPK 15蛋白之間的相互作用。主要研究結(jié)果如下：(1)通過電子克隆和RT-PCR擴(kuò)增,從甘蔗中克隆獲得4個(gè)ScCBLs和10個(gè)ScCIPKs家族基因。生物信息學(xué)分析顯示,所獲得的甘蔗ScCBLs蛋白都含有EF-hands結(jié)構(gòu)域、Ca2+結(jié)合位點(diǎn)以及EFh superfamily結(jié)構(gòu)域；ScCIPKs蛋白含有PKc.like superfamily和AMPKA.C-like superfamily,有一個(gè)CBL interaction結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)潛在的PP2C結(jié)合位點(diǎn),這些結(jié)果與高粱、水稻同源的CBL和CIPK編碼蛋白的氨基酸序列特征高度相似。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,甘蔗CBL蛋白和CIPK蛋白與其他物種的CBL和CIPK蛋白都可以歸類到各自的亞族中。(2)組織特異性表達(dá)的RT-qPCR分析顯示,兩個(gè)基因家族在甘蔗芽、髓、葉、分生組織和皮中均有表達(dá),其中4個(gè)ScCBLs基因在分生組織、蔗芽和蔗髓中均有較高的表達(dá)；10個(gè)ScCIPKs基因中,ScCIPK4, ScCIPK15、和ScCIPK21在皮中有較高的表達(dá)量,ScCIPK5、ScCIPK110、ScCIP14在芽的表達(dá)量較高；僅有ScCIPK8在分生組織中有較高的表達(dá)量；ScCIPK9、ScCIPK17、ScCIPK28在葉中的表達(dá)量較高。(3)不同外源脅迫下基因表達(dá)的RT-qPCR分析表明,甘蔗中特定的ScCBL和ScCIPK對(duì)非生物脅迫外源因子ABA,鹽(NaCl)脅迫、干旱(PEG)脅迫以及氯化鈣(CaCl2)脅迫處理有不同的響應(yīng)模式,且同一處理能夠被不同的ScCBL和ScCIPK基因感應(yīng),說明不同甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因在應(yīng)對(duì)非生物脅迫逆境中協(xié)同發(fā)揮作用,同時(shí)生物脅迫(接種花葉病毒)中,表現(xiàn)出了不同的表達(dá)水平。(4)雙分子熒光互補(bǔ)雜交(BIFC)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘蔗ScCBL2和ScCIPK 15蛋白之間相互作用,形成CBL-CIPK復(fù)合物來解碼特異性的Ca2+信號(hào),從而轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號(hào)。
【關(guān)鍵詞】：甘蔗 CBL CIPK RT-PCR 定量熒光PCR 雙分子熒光互補(bǔ)雜交 相互作用
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S566.1
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 前言12-18
• 1.1 鈣離子信號(hào)的產(chǎn)生與傳遞12
• 1.2 Ca~(2+)信號(hào)感受器的特征和分類12-14
• 1.2.1 CaM/CML信號(hào)系統(tǒng)12-13
• 1.2.2 CDPK信號(hào)系統(tǒng)13
• 1.2.3 CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)13-14
• 1.3 CBL-CIPK信號(hào)通路研究進(jìn)展14-16
• 1.3.1 CBL蛋白的結(jié)構(gòu)特征14
• 1.3.2 CIPK蛋白的結(jié)構(gòu)特征14-15
• 1.3.3 CBL-CIPK信號(hào)通路的激活及其相互作用15
• 1.3.4 CBL-CIPK信號(hào)通路參與植物的逆境響應(yīng)15-16
• 1.4 本研究的目的及意義16-17
• 1.5 本研究的技術(shù)路線圖17-18
• 第二章 甘蔗ScCBLs基因家族的分離鑒定和表達(dá)分析18-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2.1.1 植物材料處理18-19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-22
• 2.2.1 甘蔗總RNA提取19
• 2.2.2 cDNA第一條鏈合成19-20
• 2.2.3 目的基因克隆20-21
• 2.2.3.1 目的基因獲得20
• 2.2.3.2 引物設(shè)計(jì)20-21
• 2.2.3.3 目的基因克隆21
• 2.2.4 目的基因的生物信息學(xué)分析21-22
• 2.2.5 目的基因表達(dá)分析22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-33
• 2.3.1 4個(gè)甘蔗ScCBLs基因序列的獲得23-25
• 2.3.2 4個(gè)甘蔗ScCBLs基因生物信息學(xué)分析25-27
• 2.3.2.1 4個(gè)甘蔗ScCBLs基因編碼蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)25-26
• 2.3.2.2 4個(gè)甘蔗ScCBLs蛋白二級(jí)結(jié)果預(yù)測(cè)與分析26
• 2.3.2.3 4個(gè)甘蔗ScCBLs蛋白功能預(yù)測(cè)26-27
• 2.3.2.4 4個(gè)甘蔗ScCBLs蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)27
• 2.3.3 4個(gè)甘蔗ScCBLs蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析27-28
• 2.3.4 4個(gè)甘蔗ScCBLs基因編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析28-31
• 2.3.5 4個(gè)甘蔗ScCBLs甘蔗基因的表達(dá)分析31-33
• 2.3.5.1 4個(gè)ScCBLs基因在甘蔗中的組織特異性表達(dá)分析31
• 2.3.5.2 生物脅迫下4個(gè)甘蔗ScCBLs基因表達(dá)特性31-32
• 2.3.5.3 非生物脅迫下4個(gè)甘蔗ScCBLs基因的表達(dá)特性32-33
• 2.4 討論與結(jié)論33-35
• 2.4.1 甘蔗ScCBLs的克隆與生物學(xué)分析33-34
• 2.4.2 甘蔗ScCBLs組織特異性表達(dá)分析34
• 2.4.3 甘蔗ScCBLs對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)答34-35
• 第三章 甘蔗ScCIPKs基因家族的分離鑒定和表達(dá)分析35-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 3.1.1 植物材料處理35
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法35-38
• 3.2.1 甘蔗總RNA提取35
• 3.2.2 cDNA第—條鏈合成35
• 3.2.3 目的基因克隆35-37
• 3.2.3.1 目的基因獲得35-36
• 3.2.3.2 引物設(shè)計(jì)36
• 3.2.3.3 目的基因克隆36-37
• 3.2.4 目的基因的生物信息學(xué)分析37
• 3.2.5 目的基因表達(dá)分析37-38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-58
• 3.3.1 10個(gè)甘蔗ScCIPKs基因序列的獲得38-45
• 3.3.2 10個(gè)甘蔗ScCIPKs基因生物信息學(xué)分析45-46
• 3.3.2.1 10個(gè)甘蔗ScCIPKs基因編碼蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)45
• 3.3.2.2 10個(gè)甘蔗ScCIPKs蛋白二級(jí)結(jié)果預(yù)測(cè)與分析45-46
• 3.3.2.3 10個(gè)甘蔗ScCIPKs蛋白功能預(yù)測(cè)46
• 3.3.2.4 10個(gè)甘蔗ScCIPKs蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)46
• 3.3.3 10個(gè)甘蔗ScCIPKs蛋白的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析46-50
• 3.3.4 10個(gè)甘蔗ScCIPKs基因編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析50-53
• 3.3.5 10個(gè)甘蔗ScCIPKs基因的表達(dá)分析53-58
• 3.3.5.1 10個(gè)ScCIPKs基因在甘蔗中組織特異性表達(dá)分析53-54
• 3.3.5.2 生物脅迫下10個(gè)甘蔗ScCIPKs基因的表達(dá)特性54-55
• 3.3.5.3 非生物脅迫下10個(gè)甘蔗ScCIPKs基因的表達(dá)特性55-58
• 3.4 討論與結(jié)論58-61
• 3.4.1 甘蔗ScCIPKs家族基因的克隆與生物學(xué)分析58-59
• 3.4.2 甘蔗ScCIPKs家族基因組織特異性表達(dá)分析59
• 3.4.3 甘蔗ScCIPKs基因?qū)ι锩{迫和非生物脅迫的應(yīng)答59-61
• 第四章 甘蔗ScCBL2與ScCIPK15蛋白的互作分析61-68
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料61-62
• 4.1.1 植物材料61
• 4.1.2 菌種和質(zhì)粒61
• 4.1.3 工具酶和試劑盒61-62
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法62-63
• 4.2.1 甘蔗ScCBL2和ScCIPK15互作載體的構(gòu)建62
• 4.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備62-63
• 4.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌63
• 4.2.4 農(nóng)桿菌侵染本氏煙及葉片觀察63
• 4.3 結(jié)果分析63-66
• 4.3.1 甘蔗ScCBL2和ScCIPK15加接頭引物PCR反應(yīng)的鑒定63-64
• 4.3.2 BP反應(yīng)重組質(zhì)粒pDNOR221-X的PCR鑒定64
• 4.3.3 LR反應(yīng)重組載體質(zhì)粒鑒定64-65
• 4.3.4 甘蔗ScCBL2和ScCIPK15的陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株P(guān)CR鑒定65
• 4.3.5 甘蔗ScCBL2和ScCIPK15的BIFC互作結(jié)果65-66
• 4.4 討論與結(jié)論66-68
• 第五章 主要結(jié)論以及后續(xù)研究68-70
• 5.1 主要結(jié)論68-69
• 5.2 后續(xù)研究69-70
• 參考文獻(xiàn)70-78
• 致謝78

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃瓏;甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆與鑒定[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆與鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：367307