本文關(guān)鍵詞：弓形蟲棒狀體頸部蛋白5和10基因的免疫保護作用及其基因缺失株的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種可感染幾乎所有脊椎動物的專性細胞內(nèi)寄生原蟲,引起弓形蟲病。全球約1/3的人受到感染,該病嚴重危害人類的生命和健康。由于藥物治療無法徹底治愈弓形蟲病,因此免疫預(yù)防就成為控制該病的首選。但目前為止,尚未有有效、安全的疫苗用來預(yù)防人類弓形蟲病。棒狀體是弓形蟲所特有的一種亞細胞器,其分泌的蛋白根據(jù)不同部位分為棒狀體基部蛋白(rhoptry proteins,ROPs)和棒狀體頸部蛋白(rhoptry neck proteins,RONs)。目前,在弓形蟲體內(nèi)已經(jīng)被證實的RONs有8種,分別為RON1、RON2、RON3、RON4、RON5、RON8、RON9及RON10,研究證明大部分RONs與弓形蟲入侵宿主細胞有關(guān)。本研究的第一部分首次對12株來自國內(nèi)外不同宿主與地理來源的弓形蟲分離株的棒狀體頸部蛋白10(RON10)基因gDNA序列進行PCR擴增、克隆及測序。通過同源性搜索、序列比對分析、構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹,結(jié)果表明弓形蟲RON10基因在12個不同分離株中序列相對保守,但不是用于對弓形蟲進行基因分型的理想的遺傳標記分子。由于強弱毒株間變異小,推測RON10基因可能是重要的抗弓形蟲疫苗候選抗原。本研究的第二部分分別構(gòu)建了pVAX-RON5p和pVAX-RON10真核表達質(zhì)粒,經(jīng)肌肉注射途徑免疫BALB/c小鼠。三次免疫后測定相應(yīng)的體液和細胞免疫應(yīng)答水平,并用弓形蟲RH和PRU蟲株進行攻蟲感染。結(jié)果顯示,兩個實驗組小鼠均可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好的體液和細胞免疫應(yīng)答,pVAX-RON5p核酸疫苗能夠?qū)蜗xRH株和PRU株產(chǎn)生一定的交叉免疫保護力,而pVAX-RON10核酸疫苗對弓形蟲急性和慢性感染均不能產(chǎn)生免疫保護力。因此RON5基因具有一定的免疫原性,可作為候選抗原用于進一步研制實用抗弓形蟲疫苗。本研究的第三部分使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別成功構(gòu)建了弓形蟲RON5和RON10基因的敲除質(zhì)粒Cas9-sgRON5和Cas9-sgRON10。測序正確后大量提取敲除質(zhì)粒,與弓形蟲RH株速殖子按照一定比例混合,1700 V,130μs,電擊兩次,將電擊后蟲體接到Vero細胞中培養(yǎng)。電轉(zhuǎn)染72 h后進行乙胺嘧啶藥物篩選,之后收集蟲體并計數(shù),將蟲體有限稀釋后接種預(yù)鋪Vero細胞的96孔細胞培養(yǎng)板進行弓形蟲缺失株的篩選,單克隆進行擴大培養(yǎng)后提取基因組DNA,擴增靶位點小片段測序驗證。結(jié)果表明,使用常規(guī)方法無法直接得到RON5基因的缺失株,而弓形蟲△RON10株與RH株相比表型無明顯變化。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 棒狀體頸部蛋白 核酸疫苗 CRISPR/Cas9系統(tǒng) 缺失株
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• Summary5-7
• 英文縮寫對照表7-10
• 第一章 文獻綜述10-14
• 1 弓形蟲及弓形蟲病概述10-11
• 2 弓形蟲病疫苗研究進展11-12
• 3 本研究的目的和意義12-14
• 第二章 弓形蟲RON10基因序列變異的研究14-25
• 1 材料與方法14-20
• 1.1 材料14-16
• 1.2 方法16-20
• 2 結(jié)果與分析20-23
• 2.1 弓形蟲RON10基因PCR擴增結(jié)果20
• 2.2 弓形蟲RON10基因重組菌液PCR擴增結(jié)果20
• 2.3 不同蟲株之間弓形蟲RON10基因序列的變異分析20-23
• 3 討論23-25
• 第三章 弓形蟲p VAX-RON5p、p VAX-RON10 DNA疫苗的制備及免疫效果評價25-59
• 1 材料與方法25-44
• 1.1 材料25-29
• 1.2 方法29-44
• 2 結(jié)果與分析44-55
• 2.1 弓形蟲RON5p和RON10基因PCR擴增結(jié)果44-45
• 2.2 p GEM-RON5p和p GEM-RON10重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果45-47
• 2.3 p VAX-RON5p和p VAX-RON10真核表達重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果47-48
• 2.4 表達質(zhì)粒p VAX-RON5p和p VAX-RON10轉(zhuǎn)染Marc-145 細胞的免疫熒光鑒定48
• 2.5 血清中Ig G抗體和Ig G1、Ig G2a抗體亞類的檢測48-50
• 2.6 細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 和IL-12（p70）的檢測50-52
• 2.7 免疫鼠脾淋巴細胞增殖實驗（MTT法）52
• 2.8 流式細胞分選儀分析CD3e~+CD4~+CD8a~-和CD3e~+CD8a~+CD4~-細胞52-54
• 2.9 實驗鼠腹腔注射感染弓形蟲RH株的效果評價54
• 2.10 實驗鼠灌胃感染弓形蟲PRU株的效果評價54-55
• 3 討論55-59
• 第四章 弓形蟲RON5、RON10基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及其缺失株篩選59-76
• 1 材料與方法59-68
• 1.1 材料59-61
• 1.2 方法61-68
• 2 結(jié)果與分析68-73
• 2.1 Cas9-sg RON5和Cas9-sg RON10敲除質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果68-70
• 2.2 RON5和RON10缺失株的篩選及鑒定70-72
• 2.3 噬斑實驗72
• 2.4 小鼠毒力實驗72-73
• 3 討論73-76
• 第五章 全文結(jié)論76-77
• 參考文獻77-88
• 致謝88-89
• 作者簡介89-90
• 導(dǎo)師簡介90-92

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