本文關(guān)鍵詞：高危型HPV致癌基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人口腔上皮細(xì)胞，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的人乳頭瘤病毒(HPV)是一種雙鏈環(huán)狀小DNA病毒,與宮頸癌密切相關(guān),95%的宮頸癌的病例中均能檢測到人乳頭瘤病毒。大量的流行病學(xué)調(diào)查資料顯示,高危型HPV也與口腔癌的發(fā)生密切相關(guān),目前關(guān)于HPV與口腔癌關(guān)系的研究主要集中于對高危型HPV E6和E7基因的研究,而忽略對致癌基因E5的研究。E5基因存在于高危型HPV全基因組,而引起口腔良性腫瘤的低危型HPV基因組一般都缺乏E5基因,或者雖有E5基因但缺乏翻譯E5的起始密碼子;同時研究表明E5基因在腫瘤形成的早期及增強E6和E7基因?qū)?xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。本實驗分別構(gòu)建高危型HPV E5、E6和E7 3個癌基因的重組慢病毒載體,成功轉(zhuǎn)染人口腔上皮細(xì)胞,并對E5基因?qū)谇簧掀ぜ?xì)胞相關(guān)作用進(jìn)行了初步分析,為闡明高危型HPV E5基因與口腔癌的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。方法(1)PCR擴增16型人乳頭瘤病毒(HPV16)E5、E6和E7基因,利用Bam H I和Eco R I雙酶切位點構(gòu)建p LVX-Ac GFP-E5、p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7 3種慢病毒核心質(zhì)粒,經(jīng)酶切驗證及測序后,分別將正確的重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48小時后收集3種慢病毒顆粒上清,濃縮后用逐步稀釋法測定病毒滴度,并分別感染口腔上皮細(xì)胞,嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,RT-PCR和Western blot檢測目的基因的表達(dá)。(2)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染致癌基因的口腔上皮細(xì)胞株分為A、B、C、D組,其中A組穩(wěn)定感染p LVX-Ac GFP-E5、p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7慢病毒,B組穩(wěn)定感染p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7慢病毒,C組穩(wěn)定感染p LVX-Ac GFP-E5慢病毒,D組穩(wěn)定感染p LVX-Ac GFP-N1(空載體)慢病毒,未感染的口腔上皮細(xì)胞作為空白對照組(E組)。通過比較組與組之間的細(xì)胞黏附率、細(xì)胞增殖能力以及E6、E7基因m RNA水平的表達(dá)量,初步分析E5基因?qū)谇簧掀ぜ?xì)胞的致癌機制。結(jié)果(1)成功獲取E5、E6和E7基因,雙酶切驗證和DNA測序結(jié)果表明,重組慢病毒載體插入序列完全正確。(2)獲得3種慢病毒上清,逐步稀釋法檢測慢病毒載體p LVX-Ac GFP-E5、p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7病毒滴度分別為3×108 TU/ml、2×108 TU/ml和2×108 TU/ml。(3)篩選得到3個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,RT-PCR和Western blot均可檢測到HPV16 E5、E6和E7基因在口腔上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá),即3種慢病毒顆粒成功在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。(4)通過對各組細(xì)胞間的黏附率和細(xì)胞增殖能力比較及分析發(fā)現(xiàn),單獨的E5基因不能促進(jìn)口腔上皮細(xì)胞增殖和粘附(P0.05),E5基因協(xié)同E6和E7基因共轉(zhuǎn)染口腔上皮細(xì)胞能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增值(P0.05);Real time-PCR檢測E6、E7基因表達(dá)量的變化發(fā)現(xiàn),A組細(xì)胞相比較B組,其E6,E7 m RNA的表達(dá)量是上調(diào)的,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論(1)本研究構(gòu)建的高危型HPV 3個致癌基因重組慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)染口腔上皮細(xì)胞。(2)單獨的高危型HPV E5基因不能促進(jìn)口腔上皮細(xì)胞粘附和增殖,但協(xié)同E6和E7基因共同轉(zhuǎn)染時可促進(jìn)口腔上皮細(xì)胞粘附和增殖,并對E6和E7基因m RNA表達(dá)量有一定的間接上調(diào)作用,這為闡明高危型HPV E5基因與口腔癌的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人乳頭瘤病毒 HPV16致癌基因 慢病毒載體 口腔上皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.8
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 引言12-14
• 材料和方法14-25
• 結(jié)果25-32
• 討論32-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 附錄41-42
• 致謝42-43
• 綜述43-51
• 參考文獻(xiàn)48-51

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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  本文關(guān)鍵詞：高危型HPV致癌基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人口腔上皮細(xì)胞，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：366365