發(fā)布時間：2022-04-27 19:51

　　雌性激素包括雌激素與孕激素兩大類,對女性發(fā)育和生殖功能至關(guān)重要。雌激素主要有雌酮、雌二醇和雌三醇,孕激素以孕酮為主。雌激素、孕激素水平是生殖監(jiān)測中不可或缺的臨床指標(biāo),性激素六項中就包含雌二醇和孕酮,對不孕癥的病因診斷、療效觀察、預(yù)后判斷及生殖生理作用機制的研究具有重要意義。國內(nèi)外性激素常規(guī)檢查方法以血清為樣本,連續(xù)采血檢測易引起病人心理壓力,且存在安全風(fēng)險,開發(fā)快速無創(chuàng)監(jiān)測性激素水平方法有較大需求。近期研究發(fā)現(xiàn),雌酮和孕酮的尿液代謝物,雌酮-3-葡糖苷酸（Estrone-3-glucuronide,E1G）和孕二醇-3-葡糖苷酸（Pregnanediol-3-glucuronide,PdG）濃度與血清雌酮孕酮濃度呈線性相關(guān),使得通過尿液無創(chuàng)監(jiān)控雌酮孕酮水平成為可能。但是E1G和PdG分子量低、免疫原性弱,是哺乳動物體內(nèi)本身存在的代謝物,難以通過傳統(tǒng)免疫方法穩(wěn)定獲得抗體,或高特異性和高親和力抗體,成為此類檢測產(chǎn)品開發(fā)的限制因素。隨著基因工程和重組抗體技術(shù)的發(fā)展,第三代抗體尤其是抗原結(jié)合片段（Fragment antigen-binding,Fab）,在制備小分子抗原抗體中展現(xiàn)出巨大潛力。... 

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
注釋表
第一章 緒論
    1.1 雌激素與孕激素
        1.1.1 雌激素與孕激素的生理功能
        1.1.2 雌激素孕激素檢測的臨床指標(biāo)和意義
        1.1.3 雌酮孕酮代謝物及其臨床意義
        1.1.4 雌激素臨床檢測方法
    1.2 抗體
        1.2.1 抗體的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 抗體的識別
        1.2.3 抗體的制備
    1.3 基因工程抗體
        1.3.1 基因工程抗體種類
        1.3.2 Fab抗體及其應(yīng)用
        1.3.3 基因工程抗體的制備與篩選
    1.4 噬菌體抗體庫技術(shù)
        1.4.1 噬菌體展示技術(shù)
        1.4.2 噬菌體抗體庫
        1.4.3 噬菌體抗體庫技術(shù)的優(yōu)勢
    1.5 研究目的與研究內(nèi)容
        1.5.1 研究目的及研究意義
        1.5.2 研究內(nèi)容
        1.5.3 研究方法與技術(shù)路線
第二章 小鼠免疫與抗體Fab基因的擴增
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 引物序列
        2.1.3 試劑
        2.1.4 溶液配制
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 小鼠的免疫
        2.2.2 抗體效價的動態(tài)監(jiān)測
        2.2.3 脾細胞的分離
        2.2.4 總RNA的提取
        2.2.5 cDNA的合成
        2.2.6 SOE-PCR擴增Fab基因
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 抗體效價的測定
        2.3.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.3.3 抗體基因的擴增
    2.4 討論與小結(jié)
第三章 抗E1G、PdG的 Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 引物序列
        3.1.3 試劑及溶液配制
        3.1.4 主要儀器設(shè)備和耗材
    3.2 實驗方法
        3.2.1 XL1-Blue電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備
        3.2.2 噬菌體抗體重組載體的構(gòu)建
        3.2.3 Fab噬菌體抗體庫的電轉(zhuǎn)化
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 XL1-Blue感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率與污染測試結(jié)果
        3.3.2 Fab與 pComb3Xλ的酶切結(jié)果
        3.3.3 小體系連接測試結(jié)果
        3.3.4 Fab噬菌體抗體庫的電轉(zhuǎn)化
    3.4 討論與小結(jié)
第四章 抗E1G、PdG的 Fab噬菌體抗體庫的篩選
    4.1 材料與試劑
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 試劑及溶液配制
        4.1.3 主要耗材
    4.2 實驗方法
        4.2.1 輔助噬菌體的制備
        4.2.2 噬菌體抗體庫的擴增
        4.2.3 噬菌體的純化
        4.2.4 抗體庫的淘選
        4.2.5 抗體庫的第二輪擴增與淘選
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 VCSM13 輔助噬菌體的制備
        4.3.2 Fab噬菌體抗體庫的淘選
    4.4 討論與小結(jié)
第五章 抗E1G、PdG Fab抗體的分析與鑒定
    5.1 材料與試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 抗體片段的表達
        5.2.2 抗體片段ELISA
        5.2.3 DNA測序與序列分析
        5.2.4 間接競爭ELISA
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 可溶性抗體片段ELISA
        5.3.2 Sanger測序與IMGT/V-QUEST比對結(jié)果
        5.3.3 E1G抗體的交叉反應(yīng)測試
    5.4 討論與小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 展望
參考文獻
致謝
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本文編號：3649071