本文關(guān)鍵詞：大麥鹽誘導(dǎo)根系表達(dá)基因HvSR1的鑒定及其功能分析專用載體的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鹽脅迫能夠顯著影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì),而根系是植物體應(yīng)答鹽脅迫不可或缺的營養(yǎng)器官,發(fā)掘鹽誘導(dǎo)根系表達(dá)相關(guān)基因并進(jìn)行分子育種,是作物耐鹽遺傳改良的重要途徑之一。大麥?zhǔn)且粋�(gè)重要的模式作物,其基因組已完成測序。隨著測序技術(shù)的發(fā)展,大麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)急劇增長,迫切需要進(jìn)行數(shù)據(jù)的發(fā)掘和鑒定。本試驗(yàn)利用Genevestigator在線生物信息學(xué)程序,分析了8個(gè)實(shí)驗(yàn)中的48個(gè)樣品的數(shù)據(jù),篩選到四個(gè)鹽誘導(dǎo)根系表達(dá)候選基因。以大麥Morex為試驗(yàn)材料,對基因在不同組織器官和不同鹽處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證,并構(gòu)建用于大麥基因功能分析的專用載體。結(jié)果表明,探針Hv.1961對應(yīng)的基因在大麥根系受鹽脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá),命名為HvSR1基因(Salt Responsive Gene 1)。編碼區(qū)全長為1377個(gè)核苷酸,共編碼458個(gè)氨基酸;含有2個(gè)蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域,其中DUF247是植物中的一種未知功能蛋白。Csb2_I-U家族可以編碼CRISPR/CAS系統(tǒng)相關(guān)蛋白Csb2。對生物信息學(xué)的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示該基因在大麥幼根和成根中表達(dá)量較高,且成根中的表達(dá)量最高,在其它器官中表達(dá)量均很低,甚至檢測不到,表明該基因的表達(dá)具有根部特異性。在大麥幼根,該基因的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的增加而升高,證明了鹽脅迫誘導(dǎo)了該基因在根部的上調(diào)表達(dá)。構(gòu)建了兩個(gè)用于大麥基因功能分析的載體。pEGFP-UN將選擇標(biāo)記基因NPTII置于玉米的強(qiáng)啟動(dòng)子Ubiquitin的控制之下,且在T-DNA插入基因啟動(dòng)子增強(qiáng)區(qū)時(shí),能啟動(dòng)報(bào)告基因GFP的表達(dá)。pBA9N載體含有卡那霉素抗性標(biāo)記基因,并受Ubiquitin啟動(dòng)子的調(diào)控,其大小僅有6478 bp。這兩個(gè)載體為構(gòu)建大麥的突變體庫奠定了很好的前期基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：大麥 鹽脅迫可誘導(dǎo)基因 根部特異性基因 T-DNA Ubiquitin啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S512.3;Q943.2
【目錄】：

• 摘要15-16
• Abstract16-18
• 第一章 引言18-32
• 1 文獻(xiàn)綜述18-29
• 1.1 土壤鹽漬化及其危害植物的作用機(jī)理18-20
• 1.1.1 土壤鹽漬化18-19
• 1.1.2 土壤鹽漬化危害植物生長的作用機(jī)理19-20
• 1.2 植物的耐鹽機(jī)制20-25
• 1.2.1 植物的耐鹽性及耐鹽機(jī)制的種類20-21
• 1.2.2 植物形態(tài)上的適應(yīng)性21-22
• 1.2.3 滲透調(diào)節(jié)22
• 1.2.4 拒鹽和離子區(qū)隔化22-23
• 1.2.5 活性氧清除機(jī)制23-24
• 1.2.6 植物鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)24-25
• 1.3 大麥耐鹽性的研究進(jìn)展25-26
• 1.4 生物信息學(xué)在發(fā)現(xiàn)抗逆相關(guān)基因中的應(yīng)用26
• 1.5 基因功能分析專用載體簡介26-29
• 1.5.1 綠色熒光蛋白簡介26-27
• 1.5.2 Ubiquitin啟動(dòng)子簡介27-28
• 1.5.3 NPTII基因簡介28
• 1.5.4 pUCm-T克隆載體簡介28-29
• 2 本文研究的內(nèi)容29-30
• 3 本試驗(yàn)的研究意義30-32
• 第二章 大麥鹽誘導(dǎo)根系表達(dá)基因HvSR1的鑒定32-45
• 1 材料32-35
• 1.1 試驗(yàn)材料32-33
• 1.1.1 試驗(yàn)植物32
• 1.1.2 生物信息學(xué)軟件32
• 1.1.3 PCR引物32-33
• 1.2 主要藥品與試劑的配置33-34
• 1.2.1 藥品33
• 1.2.2 主要試劑的配置33-34
• 1.3 主要儀器和設(shè)備34-35
• 2 試驗(yàn)方法35-38
• 2.1 大麥的種植方法35
• 2.2 生物信息學(xué)篩選目的基因35
• 2.3 大麥幼苗根部鹽處理試驗(yàn)35-36
• 2.4 大麥各個(gè)組織器官取材試驗(yàn)36
• 2.5 大麥各個(gè)組織器官及鹽處理植株幼根RNA的提取及cDNA的制備36-37
• 2.5.1 大麥各個(gè)組織器官及鹽處理植株幼根RNA的提取36
• 2.5.2 大麥cDNA的制備36-37
• 2.6 檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物37
• 2.7 用特異性引物擴(kuò)增cDNA驗(yàn)證目的基因的表達(dá)模式37-38
• 3 結(jié)果與分析38-43
• 3.1 生物信息學(xué)篩選根部特異性鹽誘導(dǎo)基因38-40
• 3.1.1 利用Genevestigator數(shù)據(jù)庫初步篩選目的基因38-39
• 3.1.2 基因CDS序列的獲得39-40
• 3.2 RT-PCR驗(yàn)證基因HvSR1在各個(gè)組織器官中的表達(dá)量模式40
• 3.3 RT-PCR驗(yàn)證鹽脅迫下基因HvSR1在根部的表達(dá)模式40
• 3.4 HvSR1基因的序列分析40-43
• 4 討論43-45
• 第三章 用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-UN的構(gòu)建45-62
• 1 材料45-48
• 1.1 試驗(yàn)材料45
• 1.1.1 生物信息學(xué)軟件45
• 1.1.2 PCR引物45
• 1.1.3 質(zhì)粒和菌種45
• 1.2 主要藥品與試劑的配制45-48
• 1.2.1 主要藥品45-46
• 1.2.2 主要試劑的配置46-47
• 1.2.3 主要儀器和設(shè)備47-48
• 2 試驗(yàn)方法48-54
• 2.1 質(zhì)粒的活化48-49
• 2.2 pEASY-ubi-npt II質(zhì)粒的提取49
• 2.3 PCR擴(kuò)增目的片段ubi-npt II49-50
• 2.4 目的片段Ubi-npt II的回收50
• 2.5 回收目的片段的加A反應(yīng)50-51
• 2.6 加A產(chǎn)物與克隆載體pUCm-T的連接51
• 2.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α的制備51-52
• 2.8 連接產(chǎn)物的熱激轉(zhuǎn)化52
• 2.9 菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化菌株52-53
• 2.10 所篩選產(chǎn)物的測序53
• 2.11 重組質(zhì)粒pUCm-T-Ubi-NPTII與pEGFP質(zhì)粒的提取53
• 2.12 重組質(zhì)粒和pEGFP載體的雙酶切及回收53-54
• 2.13 酶切后pEGFP載體與目的片段的連接與轉(zhuǎn)化54
• 2.14 重組質(zhì)粒pEGFP-UN的測序鑒定與保存54
• 3 結(jié)果與分析54-60
• 3.1 對目的片段Ubi-npt II的擴(kuò)增與回收54-56
• 3.1.1 目的片段的擴(kuò)增54-55
• 3.1.2 目的片段的膠回收55-56
• 3.2 目的片段ubi-npt II與克隆載體pUCm-T的連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定與測序56-58
• 3.2.1 菌落PCR篩選鑒定陽性菌落56-57
• 3.2.2 菌落PCR篩選的陽性菌落的測序57-58
• 3.3 克隆載體pUCm-T-Ubi-NPTII與pEGFP質(zhì)粒的提取、雙酶切及回收58-59
• 3.3.1 克隆載體和pEGFP的提取和雙酶切58
• 3.3.2 酶切片段的回收及檢測58-59
• 3.4 雙酶切回收產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化與測序鑒定59-60
• 4 討論60-62
• 4.1 單子葉植物轉(zhuǎn)基因體系的建立及現(xiàn)有的用于陽性植株篩選的主要載體資源60
• 4.2 載體pEGFP-UN的優(yōu)點(diǎn)60-61
• 4.3 實(shí)驗(yàn)過程中的問題及解決61-62
• 第四章 禾谷類作物T-DNA插入突變體庫專用載體pBA9N的構(gòu)建62-74
• 1 材料62-65
• 1.1 試驗(yàn)材料62
• 1.1.1 生物信息學(xué)軟件62
• 1.1.2 PCR引物62
• 1.1.3 質(zhì)粒和菌種62
• 1.2 主要藥品與試劑的配制62-64
• 1.2.1 主要藥品62-63
• 1.2.2 主要試劑的配制63-64
• 1.3 主要儀器和設(shè)備64-65
• 2 試驗(yàn)方法65-69
• 2.1 目的片段的獲得65-67
• 2.1.1 pBract806、pDONR(amp)、pEASY-ubi-npt II質(zhì)粒的活化65
• 2.1.2 pBract806、pDONR(amp)、pEASY-ubi-npt II質(zhì)粒的提取65-66
• 2.1.3 PCR擴(kuò)增目的片段66-67
• 2.1.4 目的片段NptⅡ-attB的回收67
• 2.2 入門載體的構(gòu)建67-68
• 2.2.1 BP反應(yīng)67-68
• 2.2.2 入門載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞68
• 2.2.3 入門載體的菌落PCR鑒定68
• 2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建68-69
• 2.3.1 LR反應(yīng)68-69
• 2.3.2 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞69
• 2.3.3 表達(dá)載體的菌落PCR鑒定69
• 3 結(jié)果與分析69-73
• 3.1 目的片段NptⅡ-attB的擴(kuò)增69-70
• 3.2 入門載體pDONRN的構(gòu)建70-71
• 3.3 表達(dá)載體pBA9N的構(gòu)建71-73
• 4 討論73-74
• 第五章 結(jié)論74-76
• 參考文獻(xiàn)76-82
• 致謝82-83
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文83

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：大麥鹽誘導(dǎo)根系表達(dá)基因HvSR1的鑒定及其功能分析專用載體的構(gòu)建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：364209