本文關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)DNA聚合酶Delta四亞基和相關(guān)因子的制備鑒定及赤點(diǎn)石斑魚(yú)IκBα基因的克隆與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究論文的第一部分是斑馬魚(yú)的DNA聚合酶Delta(Polymerase Delta,polδ)四個(gè)亞基(Pold1,Pold2,Pold3,Pold4)基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建和真核表達(dá)以及斑馬魚(yú)PCNA基因的克隆、原核表達(dá)及其互作蛋白的鑒定等方面的初步探索。經(jīng)典模式生物斑馬魚(yú)體內(nèi)87%的基因與人源基因相似,這意味著斑馬魚(yú)不僅可以用于研究魚(yú)類病原體感染途徑及致病機(jī)理,也可用于探究人類疾病的致病機(jī)理。真核細(xì)胞DNA polδ是染色體DNA復(fù)制中主要的復(fù)制酶,也參與多種形式的DNA損傷修復(fù)過(guò)程。而細(xì)胞增殖抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作為引導(dǎo)DNA polδ至復(fù)制叉上發(fā)揮作用的重要輔助因子,在DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)等細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用。近年來(lái),polδ的大規(guī)模分離純化技術(shù)已經(jīng)有很大的進(jìn)步,其具體生理生化功能也有大量的研究報(bào)道,但斑馬魚(yú)DNA polδ的研究報(bào)道甚少。本研究將斑馬魚(yú)DNA polδ的一個(gè)或多個(gè)亞基基因與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBDM進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建,獲得不同亞基基因組合的重組質(zhì)粒。利用新型的MultiBac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了含有斑馬魚(yú)DNA polδ不同亞基組合的重組病毒。同時(shí)嘗試?yán)谜婧讼到y(tǒng)制備重組polδ酶蛋白復(fù)合物。Western Blot分析表明,斑馬魚(yú)DNA polδ各亞基在Sf-9細(xì)胞中均能成功表達(dá);質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)各重組蛋白分別由Pold1、Pold2、Pold4所編碼。本研究還對(duì)斑馬魚(yú)PCNA基因進(jìn)行了克隆和重組質(zhì)粒的構(gòu)建,并通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了重組PCNA蛋白。利用CNBr-activated SepharoseTM 4B制備重組PCNA蛋白親和層析柱,結(jié)合親和層析及質(zhì)譜技術(shù)篩選鑒定斑馬魚(yú)PCNA的互作蛋白。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示PCNA互作蛋白主要參與DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控等細(xì)胞生理活動(dòng)。本部分的研究為深入研究polδ在機(jī)體繁殖和胚胎發(fā)育的功能奠定了基礎(chǔ),為后續(xù)開(kāi)發(fā)斑馬魚(yú)polδ缺陷型相關(guān)疾病模型提供依據(jù)。本論文的第二部分進(jìn)行了赤點(diǎn)石斑魚(yú)NF-κB因子抑制蛋白IκBα基因的分子克隆與功能分析。水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的惡化給我國(guó)魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。石斑魚(yú)是重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類,研究其自身免疫相關(guān)基因及其作用機(jī)制,有利于提高石斑魚(yú)的免疫力及抗病力而達(dá)到健康養(yǎng)殖的目的。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為聯(lián)系天然免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)的紐帶,參與機(jī)體免疫和發(fā)育的多種生理活動(dòng)。本研究通過(guò)5'-和3'-RACE技術(shù)克隆并鑒定了一個(gè)編碼赤點(diǎn)石斑魚(yú)NF-κB因子抑制蛋白IκBα基因(命名為EaIκBα)。為進(jìn)一步分析其表達(dá)模式及抗病毒能力,本研究對(duì)EaIκBα基因進(jìn)行原核表達(dá)并檢測(cè)其在石斑魚(yú)各組織的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示,EaIκBα基因在免疫組織血細(xì)胞、頭腎以及肝臟中都有較高的表達(dá)。經(jīng)LPS、溶藻弧菌和石斑魚(yú)虹彩病毒SGIV刺激石斑魚(yú)后,對(duì)EaIκBα在頭腎中的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析,結(jié)果顯示其表達(dá)量都有不同程度的升高,表明EaIκBα在細(xì)菌和病毒的感染中發(fā)揮了相對(duì)重要的作用。另外,研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)的EaIκBα能抑制SGIV感染的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)進(jìn)程,降低病毒主要衣殼蛋白MCP和核心蛋白ORF162的表達(dá)。綜上研究結(jié)果表明,EaIκBα在宿主抵御細(xì)菌和病毒感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用,為進(jìn)一步探索石斑魚(yú)免疫機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚(yú) DNApolδ PCNA 赤點(diǎn)石斑魚(yú) IκBα 分子克隆 重組表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 緒論11-24
• 1.1 經(jīng)典模式生物斑馬魚(yú)的研究現(xiàn)狀11-13
• 1.1.1 細(xì)菌及病毒感染斑馬魚(yú)模型的研究11-12
• 1.1.2 斑馬魚(yú)模型與人類疾病的研究12-13
• 1.2 真核生物DNA聚合酶 δ 的研究進(jìn)展13-16
• 1.2.1 DNA聚合酶 δ 的亞基組成及功能13-14
• 1.2.2 DNA pol δ-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的建立14-15
• 1.2.3 DNA聚合酶 δ 與人類疾病15-16
• 1.3 細(xì)胞增殖抗原PCNA的研究現(xiàn)狀16-18
• 1.4 石斑魚(yú)及其疾病模型研究進(jìn)展18-21
• 1.4.1 NF-κB信號(hào)通路在魚(yú)類先天性免疫中的作用的研究進(jìn)展18-20
• 1.4.2 石斑魚(yú)及其疾病研究20-21
• 1.5 立題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容21-24
• 1.5.1 本論文的立題依據(jù)21-23
• 1.5.2 本論文的研究?jī)?nèi)容23-24
• 第二章 斑馬魚(yú)DNA pol δ 四亞基基因的克隆、重組病毒的制備及真核表達(dá)24-56
• 2.1 材料與試劑24-29
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)種、載體、受體菌及細(xì)胞株24
• 2.1.2 主要的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備24-25
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及配制方法25-29
• 2.2 方法29-43
• 2.2.1 斑馬魚(yú)mRNA的提取29-30
• 2.2.2 斑馬魚(yú)cDNA模板的合成30-31
• 2.2.3 相關(guān)的引物設(shè)計(jì)31-32
• 2.2.4 斑馬魚(yú)DNA pol δ 四亞基與pFBDM重組質(zhì)粒的構(gòu)建32-39
• 2.2.5 藍(lán)白斑篩選重組Bacmids39-40
• 2.2.6 Sf-9 細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)40
• 2.2.7 脂質(zhì)體包埋法制備重組病毒40-41
• 2.2.8 目的蛋白的表達(dá)與Western Blot檢測(cè)41-43
• 2.2.9 質(zhì)譜鑒定樣品43
• 2.3 結(jié)果與分析43-54
• 2.3.1 斑馬魚(yú)DNA聚合酶Delta四亞基基因的克隆結(jié)果分析43-47
• 2.3.2 斑馬魚(yú)DNA pol δ 四亞基不同組合重組Bacmids的PCR鑒定47-48
• 2.3.3 各亞基組合在真核系統(tǒng)中表達(dá)分析48-52
• 2.3.4 質(zhì)譜鑒定分析52-54
• 2.4 小結(jié)與討論54-56
• 第三章 斑馬魚(yú)細(xì)胞增殖抗原（PCNA）的克隆與原核表達(dá)純化及應(yīng)用56-72
• 3.1 材料與試劑56-57
• 3.1.1 材料56
• 3.1.2 試劑56-57
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備57
• 3.2 方法57-64
• 3.2.1 一般實(shí)驗(yàn)方法57
• 3.2.2 斑馬魚(yú)PCNA基因的重組構(gòu)建57-58
• 3.2.3 PCNA蛋白在大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)58-59
• 3.2.4 目的蛋白的分離純化59-61
• 3.2.5 目的蛋白與CNBr-activated SepharoseTM 4B耦聯(lián)61-62
• 3.2.6 目的蛋白-SepharoseTM 4B親和層析柱的應(yīng)用62-64
• 3.3 結(jié)果與分析64-70
• 3.3.1 斑馬魚(yú)PCNA的基因克隆分析64-65
• 3.3.2 斑馬魚(yú)PCNA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)65-66
• 3.3.3 斑馬魚(yú)PCNA蛋白的大規(guī)模分離純化66-67
• 3.3.4 PCNA親和層析柱的制備及應(yīng)用67-69
• 3.3.5 QE質(zhì)譜結(jié)果分析69-70
• 3.4 小結(jié)與討論70-72
• 第四章 赤點(diǎn)石斑魚(yú)NF-κB因子抑制蛋白IκBα 基因的分子克隆與功能研究72-88
• 4.1 材料與試劑72
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、病毒及其它微生物細(xì)胞72
• 4.1.2 質(zhì)粒載體和受體菌株72
• 4.1.3 試劑盒及試劑72
• 4.2 方法72-79
• 4.2.1 SGIV病毒的擴(kuò)增72-73
• 4.2.2 組織樣品的采集及免疫刺激73
• 4.2.3 赤點(diǎn)石斑魚(yú)mRNA提取及cDNA的合成73
• 4.2.4 相關(guān)引物設(shè)計(jì)73-74
• 4.2.5 以 5'-和 3'-RACE技術(shù)擴(kuò)增目的基因編碼序列74-76
• 4.2.6 pET28a-EaIκBα 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建76-77
• 4.2.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)77-78
• 4.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EaIκBα mRNA表達(dá)78
• 4.2.9 EaIκBα 抗病毒活性分析78-79
• 4.3 結(jié)果與分析79-86
• 4.3.1 EaIκBα 全長(zhǎng)擴(kuò)增和序列分析79-80
• 4.3.2 EaIκBα 氨基酸序列的同源性分析及進(jìn)化關(guān)系80-82
• 4.3.3 石斑魚(yú)EaIκBα 基因表達(dá)模式分析82-84
• 4.3.4 EaIκBα 的原核表達(dá)結(jié)果分析84
• 4.3.5 EaIκBα 抗病毒活性分析84-86
• 4.4 小結(jié)與討論86-88
• 總結(jié)與展望88-90
• 總結(jié)88-89
• 展望89-90
• 參考文獻(xiàn)90-98
• 致謝98-99
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果99

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2 ;法國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)造血干細(xì)胞生成機(jī)理[J];廣西科學(xué)院學(xué)報(bào);2010年01期

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7 朱琳,史淑潔;斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育技術(shù)在毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2002年02期

8 董武,楊景峰,王思珍,高原,解顏炯,馬國(guó)文;二VA英污染引起的特異性下頜短小—斑馬魚(yú)下頜形態(tài)學(xué)檢測(cè)[J];內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年03期

9 蔡翔,王捷,王穎;應(yīng)用胚胎檢測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)氟嗎啉對(duì)斑馬魚(yú)胚胎-幼體發(fā)育的影響[J];農(nóng)藥;2005年06期

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5 侯佳;桂永浩;張立鳳;王躍祥;宋后燕;鐘濤;;視黃酸缺乏對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)兒科中青年學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2008年

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1 劉妍;美國(guó)培育出終生透明的斑馬魚(yú)[N];中國(guó)漁業(yè)報(bào);2008年

2 本報(bào)記者 滕繼濮;小小斑馬魚(yú) 大大有用處[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

3 楓葉　編譯;篩選藥物：斑馬魚(yú)責(zé)任重大[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2012年

4 記者 熊琳暉 通訊員 孫慧;研究斑馬魚(yú)揭示器官再生之謎[N];長(zhǎng)江日?qǐng)?bào);2013年

5 羅剛 李兵;斑馬魚(yú)破譯人類基因的先鋒[N];健康報(bào);2004年

6 記者 李學(xué)梅;斑馬魚(yú)為治療白血病提新思路[N];新華每日電訊;2010年

7 本報(bào)記者 許琦敏;靜候那一點(diǎn)流星似的光亮[N];文匯報(bào);2012年

8 本報(bào)記者 許琦敏;劉廷析 “掘?qū)殹卑唏R魚(yú)世界[N];文匯報(bào);2011年

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1 管翊閎;核仁因子Def磷酸化修飾調(diào)控細(xì)胞周期和p53降解的研究[D];浙江大學(xué);2015年

2 胡晶瑩;環(huán)境雌激素影響斑馬魚(yú)生殖系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制的初步研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

3 趙婷;Karsch-Neugebauer綜合征斑馬魚(yú)模型的建立和行為學(xué)觀察[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

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  本文關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)DNA聚合酶Delta四亞基和相關(guān)因子的制備鑒定及赤點(diǎn)石斑魚(yú)IκBα基因的克隆與功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：364574