發(fā)布時(shí)間：2017-05-13 07:26

  本文關(guān)鍵詞：Chitinase轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒（HearNPV）增效作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(Hear NPV)含有的幾丁質(zhì)酶在昆蟲(chóng)液化和病毒與寄主傳播水平上有著重要作用。此外,原核表達(dá)的幾丁質(zhì)酶還可以增強(qiáng)Hear NPV的感染效率和殺蟲(chóng)毒力。而幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)消化道一個(gè)重要的結(jié)構(gòu),是昆蟲(chóng)體內(nèi)中腸中天然屏障圍食膜的重要組成成分,即在昆蟲(chóng)自身保護(hù)其免受腸內(nèi)容物的傷害中扮演重要角色。在這項(xiàng)研究中,以擬南芥(Arabidopsis thaliana)為植物載體,利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的花序侵染法對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)化了Chitinase外源基因,并進(jìn)行了其對(duì)棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,Hear NPV)增效作用研究,取得如下結(jié)果:1、利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得了6株表現(xiàn)型為陽(yáng)性的Chitinase轉(zhuǎn)基因擬南芥株系,通過(guò)PCR檢測(cè)初步確定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化擬南芥株系。2、通過(guò)RT-PCR檢測(cè),表明目的基因Chitinase在6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)-F中都有表達(dá),并且株系A(chǔ)的相對(duì)表達(dá)量最高,株系D的相對(duì)表達(dá)量最低。3、Chitinase轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Hear NPV的增效作用試驗(yàn)表明,飼喂株系A(chǔ)的棉鈴蟲(chóng)感染Hear NPV后的LT50和LT90比取食野生型擬南芥對(duì)照組分別縮短了36.17%和40.33%。飼喂株系D的棉鈴蟲(chóng)感染Hear NPV后的LT50和LT90比對(duì)照組分別縮短了18.08%和25.14%。4、感染相同劑量的棉鈴蟲(chóng)在取食轉(zhuǎn)基因植物后病毒在細(xì)胞中DNA拷貝數(shù)顯著高于取食野生型植物的棉鈴蟲(chóng),其中取食轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)的棉鈴蟲(chóng)感染Hear NPV后其細(xì)胞體內(nèi)病毒復(fù)制能力最強(qiáng)也最快,其次是取食株系D的棉鈴蟲(chóng)。5、取食轉(zhuǎn)基因擬南芥的棉鈴蟲(chóng)病毒產(chǎn)量明顯高于取食野生型擬南芥,且取食轉(zhuǎn)基因擬南芥株系A(chǔ)的棉鈴蟲(chóng)病毒產(chǎn)量明顯高于取食轉(zhuǎn)基因株系D的棉鈴蟲(chóng)。6、感染HearNPV的棉鈴蟲(chóng)無(wú)論取食野生型擬南芥、株系A(chǔ)或株系D,其日均蟲(chóng)重均無(wú)顯著性差異;單取食轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥未感染病毒的棉鈴蟲(chóng)日累積增重沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物單獨(dú)飼喂對(duì)棉鈴蟲(chóng)不會(huì)有很大影響。結(jié)果表明,Chitinase轉(zhuǎn)基因擬南芥在飼喂同時(shí)感染Hear NPV的棉鈴蟲(chóng)時(shí)有利用病毒粒子更快更多的進(jìn)入昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞,且有助于病毒Hear NPV在棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的增值,以及提高病毒對(duì)棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)速度和殺蟲(chóng)效率。
【關(guān)鍵詞】：擬南芥 Chitinase 轉(zhuǎn)基因植物 HearNPV 棉鈴蟲(chóng) 增效
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S476.13
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1.1 擬南芥轉(zhuǎn)基因簡(jiǎn)介11-14
• 1.1.1 擬南芥（Arabidopsis thaliana）11-12
• 1.1.2 擬南芥浸花轉(zhuǎn)化法12-14
• 1.2 桿狀病毒簡(jiǎn)介及其應(yīng)用研究進(jìn)展14-15
• 1.2.1 桿狀病毒14
• 1.2.2 桿狀病毒在生物防治中的應(yīng)用及其特點(diǎn)14-15
• 1.2.3 桿狀病毒生物增效途徑15
• 1.3 桿狀病毒幾丁質(zhì)酶的研究15-17
• 1.3.1 桿狀病毒幾丁質(zhì)酶的功能15-16
• 1.3.2 HearNPV幾丁質(zhì)酶基因的研究16-17
• 1.4 研究目的意義17
• 1.5 技術(shù)路線17-18
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法18-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-21
• 2.1.1 植物材料18
• 2.1.2 供試蟲(chóng)體18
• 2.1.3 供試病毒和菌株18
• 2.1.4 載體18-19
• 2.1.4.1 pGEM?-T Easy Vector18-19
• 2.1.4.2 植物表達(dá)載體pSR784d19
• 2.1.5 主要試劑和試劑盒19-20
• 2.1.6 培養(yǎng)基及常用溶液配制20-21
• 2.1.6.1 細(xì)菌培養(yǎng)基20
• 2.1.6.2 緩沖液20
• 2.1.6.3 堿裂解法質(zhì)粒抽提液20-21
• 2.1.6.4 CTAB法基因組抽提液21
• 2.1.6.5 主要抗生素的配制21
• 2.1.6.6 其他試劑的配制21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-32
• 2.2.1 重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建21-24
• 2.2.1.1 PCR引物的設(shè)計(jì)及合成21
• 2.2.1.2 PCR擴(kuò)增21-22
• 2.2.1.3 PCR產(chǎn)物純化、平末端加A反應(yīng)及T載體連接反應(yīng)22-23
• 2.2.1.4 氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞23
• 2.2.1.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞23
• 2.2.1.6 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA23-24
• 2.2.1.8 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)24
• 2.2.1.9 植物表達(dá)載體pSR784d與Chitinase基因片段的粘性末端連接反應(yīng)24
• 2.2.2 重組載體Chitinase-pSR784d轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA440424-25
• 2.2.2.1 氯化鈣法制備新鮮農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞24-25
• 2.2.2.2 電穿孔法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞25
• 2.2.3 擬南芥轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因株系的獲得25-26
• 2.2.3.1 擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)25
• 2.2.3.2 農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化液的制備25-26
• 2.2.3.3 擬南芥花序侵染26
• 2.2.3.4 轉(zhuǎn)化后擬南芥培養(yǎng)和種子的收獲26
• 2.2.3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選26
• 2.2.4 T_3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測(cè)26-29
• 2.2.4.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組PCR檢測(cè)26-28
• 2.2.4.2 T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的定量RT-PCR（Quantitative RT-PCR）分析28-29
• 2.2.5 Chitinase轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)HearNPV增效作用的試驗(yàn)29-32
• 2.2.5.1 取食轉(zhuǎn)基因植株和HearNPV的棉鈴蟲(chóng)的LT50和LT90的測(cè)定29
• 2.2.5.2 取食轉(zhuǎn)基因植株和HearNPV的棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)病毒拷貝數(shù)的測(cè)定29-30
• 2.2.5.3 取食轉(zhuǎn)基因植株并感染HearNPV后的棉鈴蟲(chóng)病毒產(chǎn)量的測(cè)定30
• 2.2.5.4 取食轉(zhuǎn)基因植株HearNPV的棉鈴蟲(chóng)體幼蟲(chóng)日均累積增重量的測(cè)定30-32
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析32-41
• 3.1 Chitinase重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建32-33
• 3.1.1 Chitinase基因的克隆及測(cè)序32-33
• 3.1.2 重組植物表達(dá)載體Chitinase-pSR784d的構(gòu)建33
• 3.2 Chitinase轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得33-34
• 3.3 T_3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測(cè)34-36
• 3.3.1 PCR檢測(cè)34-35
• 3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析35-36
• 3.4 轉(zhuǎn)Chitinase基因擬南芥對(duì)HearNPV的增效作用36-41
• 3.4.1 LT_(50)和LT_(90)的測(cè)定36-38
• 3.4.2 不同處理棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的病毒DNA的定量檢測(cè)38-39
• 3.4.3 不同處理棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的病毒產(chǎn)量39-40
• 3.4.4 棉鈴蟲(chóng)日累積增重的測(cè)定40-41
• 第四章 結(jié)論與討論41-43
• 4.1 結(jié)論41
• 4.2 討論41-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 致謝47-48
• 作者簡(jiǎn)介48

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1 王毛;Chitinase轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒（HearNPV）增效作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：Chitinase轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒（HearNPV）增效作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：361941