發(fā)布時(shí)間：2021-11-27 21:51

　　植物在遭受病蟲害等生物脅迫時(shí),外界的脅迫信號(hào)可以通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑傳遞到植物細(xì)胞內(nèi),激活抗逆相關(guān)基因的表達(dá)。MAPK蛋白激酶廣泛參與植物對(duì)脅迫信號(hào)的傳遞,是調(diào)控植物抗性的關(guān)鍵基因。近年來,隨著CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated Protein）系統(tǒng)的快速發(fā)展,該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究和應(yīng)用中。而在基因組編輯的實(shí)踐中,g RNA的表達(dá)是CRISPR技術(shù)的難點(diǎn)之一。為了構(gòu)建更加高效的CRISPR載體用于作物的抗病等研究,我們創(chuàng)建了一種新的方法來表達(dá)CRISPR/Cas9技術(shù)所需的g RNA和Cas9兩個(gè)元件。本研究驗(yàn)證了該方法能夠高效率的同時(shí)編輯多個(gè)水稻基因,并獲得了抗病相關(guān)基因的靶向突變材料,取得的主要結(jié)果如下。（1）序列分析結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建CRISPR載體所用的水稻UBI10（Ubiquitin10）基因的啟動(dòng)子的5’-UTR（untranslated region）包含了一個(gè)內(nèi)含子,該內(nèi)含子具有典型的5’-GU-A-AG-3’的剪接序列... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

UBI10基因和本研究所有載體結(jié)構(gòu)示意圖

圖 2. 基于內(nèi)含子表達(dá) gRNA 的 inPTG-Cas9 融合基因的原理。A. 細(xì)胞中 mRNA 成熟過程中內(nèi)含子剪接示意圖。B. 利用 PTG 表達(dá)多個(gè) gRNA 的原理圖 (Xie et al 2015)。PTG 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，內(nèi)源 RNase P 和 RNase Z 能夠特異性識(shí)別并切割 tRNA，從而釋放 gRNAs。C. inPTG-Cas9 的結(jié)構(gòu)和原理。將含 PTG 的內(nèi)含子與 Cas9 融合為一個(gè)基因，該基因轉(zhuǎn)錄后，在 mRNA 成熟過程中，內(nèi)含子在細(xì)胞內(nèi)的剪接 (splicing) 后與編碼 Cas9 的成熟 mRNA 分開，內(nèi)含子中的 PTG 中的 tRNA 被在RNase P 和 RNase Z 精確切割并釋放所有的 gRNA。含 PTG 的內(nèi)含子與編碼 Cas9 的外顯子融合形成 inPTG-Cas9，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)基因中表達(dá) CRISPR 所有元件。Figure 2. Engineering the intron to express polycistronic tRNA-gRNA (PTG) with Cas9 formultiplex genome editing.A. Schematic illustration of intron splicing from primary mRNA.B. Schematics of PTG processing to release individual gRNAs. The endogenous RNase P and Z specifically recognizeand precisely cut the tRNA unit in the PTG transcript to release gRNAs.C. The schematic depiction of the strategy to engineer the intron to express gRNAs for multiplex genome editing. Afterintegrating the PTG between the donor and branch sites of an intron, the gRNAs are cut out from the spliced intron byendogenous RNase P and Z, while the mature mRNA is translated as normal. The intronic PTG can be fused with Cas9

利用改進(jìn)的 CRISPR/Cas9 技術(shù)靶向突變?nèi)齻�(gè)水稻 MAPK 基因的研究載體作為陽性對(duì)照，以 GFP 質(zhì)粒載體作為陰性對(duì)照。RT-PCR 反應(yīng)模板包括轉(zhuǎn)染了pRGEB32-PTG6/PTG10 、 pRGEB33-inPTG6/inPTG10 、 pRGEB34-inPTG6/inPTG10載體的水稻原生質(zhì)體 RNA。圖 3 中 RT-PCR 結(jié)果顯示，UBI10p::Cas9 和UBI10p::inPTG-Cas9 都能夠擴(kuò)增出相同大小的條帶，初步表明 inPTG 不影響內(nèi)含子的正常剪接。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物CRISPR基因組編輯技術(shù)的新進(jìn)展[J]. 李紅,謝卡斌.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(10)
[2]Plant innate immunity in rice:a defense against pathogen infection[J]. Wende Liu,Guo-Liang Wang.  National Science Review. 2016(03)



本文編號(hào)：3523111