[目的]采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增和解螺旋酶依賴的恒溫?cái)U(kuò)增方法建立丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）基因分型的方法。[方法]1.建立HCV的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系�；诃h(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）的原理,針對丙型肝炎病毒HCV-1b,2a,3和6a基因型設(shè)計(jì)每種亞型的引物�；诮饴菪负銣�?cái)U(kuò)增（HDA）的原理,設(shè)計(jì)一對通用引物以擴(kuò)增HCV-1b,3a和3b,另設(shè)計(jì)一對通用引物擴(kuò)增HCV-2a和6a,在兩個(gè)體系中分別設(shè)計(jì)各亞型的探針對HCV進(jìn)行基因分型。2.依據(jù)HCV全基因的5,UTR～Core區(qū)中各基因型特異的基因序列,用Primer Explorer V.4軟件設(shè)計(jì)1 b,2a,3和6a型對應(yīng)的引物用于LAMP擴(kuò)增,優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系。設(shè)計(jì)HCV-1/3引物和2/6引物用于HDA擴(kuò)增,每個(gè)體系設(shè)計(jì)對應(yīng)型別Taqman探針用于基因分型。3.LAMP法擴(kuò)增HCV的性能評價(jià)。將所設(shè)計(jì)的引物與對應(yīng)的模板反應(yīng),確定所設(shè)計(jì)的HCV各基因型的引物特異性。對不同型別的陽性標(biāo)本倍比稀釋,稀釋后的不同濃度的樣本平均分成10份分別提取RNA,加入對應(yīng)的特異性的引物,以10個(gè)樣本全部檢測為陽性的最... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２：?ＬＡＭＰ體系中引物與對應(yīng)的模板反應(yīng)，ＮＣ表示去離子水作為模板的陰性??

圖２：?ＬＡＭＰ體系中引物與對應(yīng)的模板反應(yīng)，ＮＣ表示去離子水作為模板的陰性??對照。??１．２?ＬＡＭＰ體系的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間。??１．２．１?ＬＡＭＰ擴(kuò)增溫度的優(yōu)化??將ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３ａ，３ｂ和６ａ引物與對應(yīng)的模板進(jìn)行反應(yīng)，分別將ＬＡＭＰ反應(yīng)??溫度設(shè)為５８。０：，６３。０：，６５１：，反應(yīng)６〇１１１丨１１。當(dāng)溫度為６５°０時(shí)＾１０／－１１３，２３，３＆，３１），６３全??部為陽性（圖３），由此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以６５°Ｃ為ＬＡＭＰ反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)溫度。??ａＮＣ??

設(shè)置４０，５０，６０ｍｉｎ三個(gè)時(shí)間梯度分別對ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３，６ａ四種基因型模板和引??物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ反應(yīng)管在４０ｍｉｎ下顯示較弱的陽性，５０，６０ｍｉｎ??后全為陽性（圖４－Ａ，Ｂ）；?ＨＣＶ－３，６ａ４０ｍｉｎ時(shí)為陰性，在５０，６０ｍｉｎ后全為陽性，??（圖４－Ｃ，Ｄ）。四個(gè)亞型在６０ｍｉｎ后反應(yīng)管無為陽性反應(yīng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇??６０ｍｉｎ作為最佳反應(yīng)時(shí)間。??ＨＣＶ－ｌｂ?ＨＣＶ－２ａ?ＨＣＶ－３?ＨＣＶ－６ａ??Ａ?Ｍ?４０?５０?６０?ＮＣ?４０?５０?６０?ｍｉｎ?＾?Ｍ?４０?５０?６０?ＮＣ＇?４０?５０?６０?ｍｉｎ??Ｂ棚ｎ??１?°。??Ｂ?Ｉ?ＩＣＹ－ｌｂ?ＴＩＣＶ－２ａ?Ｄ?ＨＣＶ－３?ＨＣＶ－６ａ??４０?５０?６０?４０?５０?６０?ｍｉｎ?ＮＣ?４０?５０?６０?４０?５０?６０?ｍｉｎ?ＮＣ??圖４．?ＬＡＭＰ體系的時(shí)間優(yōu)化。Ａ：ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ的ＬＡＭＰ反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖，ＮＣ表??示陰性對照。Ｂ丄ＡＭＰ體系在４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ條件下的ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ反應(yīng)結(jié)果??圖。Ｃ．ＨＣＶ－３，６ａ的ＬＡＭＰ反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖。Ｄ．ＨＣＶ－３，６ａ在ＬＡＭＰ反應(yīng)下??４０ｍｉｎ，５０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ?的結(jié)果圖。??２．?ＬＡＭＰ法的特異性評價(jià)??ＨＣＶ－ｌｂ，２ａ，３，６ａ的引物只與對應(yīng)的模板反應(yīng)呈黃色，與其他模板反應(yīng)為紅??色。同時(shí)，ＨＣＶ－３型的引物可以同時(shí)與模板ＨＣＶ－３ａ，３ｂ反應(yīng)，反應(yīng)管均為黃色。??ｔｅｍｐｌａｔｅ??Ａ?Ｉ?２?３?４?ＮＣ?１３?１?２?３?４?５?ＮＣ??；?——＂Ｔ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3513756