發(fā)布時(shí)間：2021-11-22 02:39

　　隨著DNA合成和測(cè)序的快速發(fā)展,菌株改造開始成為代謝工程和合成生物學(xué)中的限速步驟。我們開發(fā)了一種稱為gRNA-tRNA-array Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9（GTR-CRISPR）的系統(tǒng),用tRNA序列將多個(gè)gRNA串聯(lián)起來表達(dá),極大提高了在釀酒酵母中的基因編輯數(shù)目和效率。利用此系統(tǒng),在獲得引物后7天內(nèi),能夠構(gòu)建出質(zhì)粒并同時(shí)編輯8個(gè)基因,效率為87%,為目前世界上在釀酒酵母中編輯效率最高和數(shù)目最多的基因編輯體系。我們進(jìn)一步開發(fā)了一種更快捷的GTR-CRISPR系統(tǒng),通過將Golden Gate反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化入酵母,跳過了大腸桿菌中的構(gòu)建質(zhì)粒步驟,極大地節(jié)約了時(shí)間。利用快速方法,我們能夠在獲得引物后3天內(nèi)同時(shí)編輯6個(gè)基因,效率為60%,即使是未優(yōu)化的gRNAs效率也能達(dá)到23%。我們利用該系統(tǒng)來簡(jiǎn)化酵母脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò),僅在10天內(nèi)就完成了對(duì)8個(gè)基因的刪除,提高了游離脂肪酸產(chǎn)量約30倍。 

【文章來源】：北京化工大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系統(tǒng)的原理示意圖??

?第一章緒論???１．５?ｇＲＮＡ的兩種表達(dá)策略??如今表達(dá)多種ｇＲＮＡ?—共有兩種方法（圖１－２）：圖ａ是用單個(gè)ＲＮＡ聚合酶啟動(dòng)??子轉(zhuǎn)錄每個(gè)ｇＲＮＡ元件；圖ｂ是使用單一的啟動(dòng)子在單一轉(zhuǎn)錄物中轉(zhuǎn)錄所有ｇＲＮＡ，??然后通過不同的方式處理釋放單個(gè)ｇＲＮＡ。這個(gè)策略要求每個(gè)ｇＲＮＡ側(cè)翼具有可切割??的ＲＮＡ序列，例如自切割核酶序列（例如Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ核酶和ＨＤＶ核酶），外??源切割因子識(shí)別序列Ｃ例如Ｃｙｓ４）?［７１和內(nèi)源ＲＮＡ加工序列（例如ｔＲＮＡ序列和內(nèi)含??子）［８?３１％。目前在釀酒酵母中，己經(jīng)報(bào)道了在一個(gè)構(gòu)建體上最多５個(gè)ｇＲＮＡ的表達(dá)【５］。??制定進(jìn)一步提高多重基因編輯效率的策略將有利于應(yīng)用研宂，如構(gòu)建代謝細(xì)胞工廠和??基礎(chǔ)研究，如產(chǎn)生最小的基因組。在本課題中我們會(huì)通過這兩種策略來研究不同的??ｇＮＲＡ表達(dá)系統(tǒng)，從而找到最優(yōu)的系統(tǒng)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行多基因同時(shí)編輯。??３?ｇＲＮＡ表達(dá)元件?ｂ?單轉(zhuǎn)錄后表達(dá)??ｉｐ〇ｉｗｄ＞１?￣￣ｆｅｍｒｅｏ￣ｈＷｗｐＭｆｆｌｉ?丨丁?ｉＰｏｉｉｉｉｐｒａｉｗｔｔＯｌ￣￣ｙ?．龜丨．．ＣＴＺ］?ｔｔｄ?］Ｔ??唇辱??ｎＢＲＮＡ１?（＼９ＲＮＡ２?ｇＲＮＡ１?ｇＲＮＡ２?ｇＲＮＡ３?ｇＲＮＡ４??３ｉｉｉｌＬｕｕｕｕｕｕ??＜＾ＲＮＡ３?Ｃ＼ＴＮＡ４?初級(jí)轉(zhuǎn)錄?纟?ＲＮａｓｅＰ??ＪＬｓｓｌ?）Ｕｉ．?麵?艦?艦??畢??Ｃａｓ９?、ｇＲＮＡ１?ｘ？ＲＮＡ２?ＪＪＲＮＡ３?．?ｇＲＮＡ４?Ｗｄ］?ｆｌＲＮＡ??ｉａＬ?ｊＬｉｆｉ．?ＪＬｓｌ．?ＪＬｓＬ??圖１－２?ｇＲＮＡ的兩種表達(dá)策略??左圖是單個(gè)ＲＮＡ聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄每個(gè)ｇＲＮＡ

?第一章緒論???ｂｐ作為靶向序列。??１．８?Ｄｏｎｏｒ的設(shè)計(jì)與制備??當(dāng)ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)對(duì)酵母基因組切割之后，我們通過加入的ｄｏｎｏｉ？來對(duì)基因組進(jìn)行??編輯。在這個(gè)過程中，我們可以對(duì)基因進(jìn)行移碼突變使其無法正常表達(dá)，也可以刪除??基囚的ＯＲＦ，還可以整合新的基因到叻割位點(diǎn)中，這主要看如何對(duì)ｄｏｎｏｒ進(jìn)行設(shè)計(jì)。??Ｄｏｎｏｒ引物主要在ＧＥＮＥＷＩＺ公司中使用標(biāo)準(zhǔn)脫鹽純化方法合成，雜交熔解溫度（Ｔｍ）??約為５５?°Ｃ?（圖１－３）。ＰＣＲ反應(yīng)后，我們通過乙醇沉淀對(duì)ｄｏｎｏｒ進(jìn)行純化。不是營(yíng)養(yǎng)??缺陷型的供體ＤＮＡ在設(shè)計(jì)時(shí)加入了?Ｘｂａｌ位點(diǎn)（Ｔ＾ＣＴＡＧＡ），方便后續(xù)基因編輯結(jié)??果驗(yàn)證，其側(cè)翼為同源修復(fù)序列？??二魏一????目標(biāo)ｉ因?＞???目標(biāo)基因?＞???＼?＼８ｂｐ／?／??�。蹋。�?ＭＩＣＨＨ�。�?＂ｉＣＫＪｆａｐ?供體?ｆｆｌｆｆＴＯｆｆＷｉ．ｉ，ｉｉｉ?丨?ＸＵ?丨?１２０ｂｐｆ共體??ＰＣＨ２－６０ｔ＞ｐ?為蝝苷酸?ＰＣＲ?忙洎?２￣７０ｂｐ？５ＵＨ?鲅??圖１－３?ＧＴＲ－ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)的供體ＰＣＲ產(chǎn)生的圖示??通過ＰＣＲ擴(kuò)增兩個(gè)寡核苷酸引物產(chǎn)生用于修復(fù)ＤＳＢ的供體。圖ａ是基因８?ｂｐ刪除供體ＤＮＡ的??設(shè)計(jì)，我們?cè)冢?ｂｐ基因的上下游各選擇５０?ｂｐ的同源臂，通過兩個(gè)寡核苷酸引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增：??圖ｂ是基因ＯＲＦ缺失供體ＤＮＡ的設(shè)計(jì)，我們?cè)诎袠?biāo)基因的ＯＲＦ上下游各選擇了?６０?ｂｐ的同源臂，??通過兩個(gè)寡核苷酸引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增??Ｆｉｇ?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｄｏｎｏｒ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＧＴＲ


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