CRISPR-Cas9系統(tǒng):應(yīng)用于釀酒酵母的一步多靶點基因編輯技術(shù)
發(fā)布時間:2021-11-22 02:39
隨著DNA合成和測序的快速發(fā)展,菌株改造開始成為代謝工程和合成生物學(xué)中的限速步驟。我們開發(fā)了一種稱為gRNA-tRNA-array Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9(GTR-CRISPR)的系統(tǒng),用tRNA序列將多個gRNA串聯(lián)起來表達(dá),極大提高了在釀酒酵母中的基因編輯數(shù)目和效率。利用此系統(tǒng),在獲得引物后7天內(nèi),能夠構(gòu)建出質(zhì)粒并同時編輯8個基因,效率為87%,為目前世界上在釀酒酵母中編輯效率最高和數(shù)目最多的基因編輯體系。我們進一步開發(fā)了一種更快捷的GTR-CRISPR系統(tǒng),通過將Golden Gate反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化入酵母,跳過了大腸桿菌中的構(gòu)建質(zhì)粒步驟,極大地節(jié)約了時間。利用快速方法,我們能夠在獲得引物后3天內(nèi)同時編輯6個基因,效率為60%,即使是未優(yōu)化的gRNAs效率也能達(dá)到23%。我們利用該系統(tǒng)來簡化酵母脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò),僅在10天內(nèi)就完成了對8個基因的刪除,提高了游離脂肪酸產(chǎn)量約30倍。
【文章來源】:北京化工大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】:96 頁
【學(xué)位級別】:碩士
【部分圖文】:
圖1-1?CRISPR-Cas9系統(tǒng)的原理示意圖??
?第一章緒論???1.5?gRNA的兩種表達(dá)策略??如今表達(dá)多種gRNA?—共有兩種方法(圖1-2):圖a是用單個RNA聚合酶啟動??子轉(zhuǎn)錄每個gRNA元件;圖b是使用單一的啟動子在單一轉(zhuǎn)錄物中轉(zhuǎn)錄所有gRNA,??然后通過不同的方式處理釋放單個gRNA。這個策略要求每個gRNA側(cè)翼具有可切割??的RNA序列,例如自切割核酶序列(例如Hammerhead核酶和HDV核酶),外??源切割因子識別序列C例如Cys4)?[71和內(nèi)源RNA加工序列(例如tRNA序列和內(nèi)含??子)[8?31%。目前在釀酒酵母中,己經(jīng)報道了在一個構(gòu)建體上最多5個gRNA的表達(dá)【5]。??制定進一步提高多重基因編輯效率的策略將有利于應(yīng)用研宂,如構(gòu)建代謝細(xì)胞工廠和??基礎(chǔ)研究,如產(chǎn)生最小的基因組。在本課題中我們會通過這兩種策略來研究不同的??gNRA表達(dá)系統(tǒng),從而找到最優(yōu)的系統(tǒng)對釀酒酵母進行多基因同時編輯。??3?gRNA表達(dá)元件?b?單轉(zhuǎn)錄后表達(dá)??ip〇iwd>1? ̄ ̄femreo ̄hWwpMffli?丨丁?iPoiiiipraiwttOl ̄ ̄y?.龜丨..CTZ]?ttd?]T??唇辱??nBRNA1?(\9RNA2?gRNA1?gRNA2?gRNA3?gRNA4??3iiilLuuuuuu??<^RNA3?C\TNA4?初級轉(zhuǎn)錄?纟?RNaseP??JLssl?)Ui.?麵?艦?艦??畢??Cas9?、gRNA1?x?RNA2?JJRNA3?.?gRNA4?Wd]?flRNA??iaL?jLifi.?JLsl.?JLsL??圖1-2?gRNA的兩種表達(dá)策略??左圖是單個RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄每個gRNA
?第一章緒論???bp作為靶向序列。??1.8?Donor的設(shè)計與制備??當(dāng)CRISPR系統(tǒng)對酵母基因組切割之后,我們通過加入的donoi?來對基因組進行??編輯。在這個過程中,我們可以對基因進行移碼突變使其無法正常表達(dá),也可以刪除??基囚的ORF,還可以整合新的基因到叻割位點中,這主要看如何對donor進行設(shè)計。??Donor引物主要在GENEWIZ公司中使用標(biāo)準(zhǔn)脫鹽純化方法合成,雜交熔解溫度(Tm)??約為55?°C?(圖1-3)。PCR反應(yīng)后,我們通過乙醇沉淀對donor進行純化。不是營養(yǎng)??缺陷型的供體DNA在設(shè)計時加入了?Xbal位點(T^CTAGA),方便后續(xù)基因編輯結(jié)??果驗證,其側(cè)翼為同源修復(fù)序列???二魏一????目標(biāo)i因?>???目標(biāo)基因?>???\?\8bp/?/??。蹋。?MICHH??"iCKJfap?供體?fflffTOffWi.i,iii?丨?XU?丨?120bpf共體??PCH2-60t>p?為蝝苷酸?PCR?忙洎?2 ̄70bp?5UH?鲅??圖1-3?GTR-CRISPR系統(tǒng)的供體PCR產(chǎn)生的圖示??通過PCR擴增兩個寡核苷酸引物產(chǎn)生用于修復(fù)DSB的供體。圖a是基因8?bp刪除供體DNA的??設(shè)計,我們在8?bp基因的上下游各選擇50?bp的同源臂,通過兩個寡核苷酸引物進行PCR擴增:??圖b是基因ORF缺失供體DNA的設(shè)計,我們在靶標(biāo)基因的ORF上下游各選擇了?60?bp的同源臂,??通過兩個寡核苷酸引物進行PCR擴增??Fig?1-3?Schematic?representation?of?donor?PCR?production?of?the?GTR
本文編號:3510765
【文章來源】:北京化工大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】:96 頁
【學(xué)位級別】:碩士
【部分圖文】:
圖1-1?CRISPR-Cas9系統(tǒng)的原理示意圖??
?第一章緒論???1.5?gRNA的兩種表達(dá)策略??如今表達(dá)多種gRNA?—共有兩種方法(圖1-2):圖a是用單個RNA聚合酶啟動??子轉(zhuǎn)錄每個gRNA元件;圖b是使用單一的啟動子在單一轉(zhuǎn)錄物中轉(zhuǎn)錄所有gRNA,??然后通過不同的方式處理釋放單個gRNA。這個策略要求每個gRNA側(cè)翼具有可切割??的RNA序列,例如自切割核酶序列(例如Hammerhead核酶和HDV核酶),外??源切割因子識別序列C例如Cys4)?[71和內(nèi)源RNA加工序列(例如tRNA序列和內(nèi)含??子)[8?31%。目前在釀酒酵母中,己經(jīng)報道了在一個構(gòu)建體上最多5個gRNA的表達(dá)【5]。??制定進一步提高多重基因編輯效率的策略將有利于應(yīng)用研宂,如構(gòu)建代謝細(xì)胞工廠和??基礎(chǔ)研究,如產(chǎn)生最小的基因組。在本課題中我們會通過這兩種策略來研究不同的??gNRA表達(dá)系統(tǒng),從而找到最優(yōu)的系統(tǒng)對釀酒酵母進行多基因同時編輯。??3?gRNA表達(dá)元件?b?單轉(zhuǎn)錄后表達(dá)??ip〇iwd>1? ̄ ̄femreo ̄hWwpMffli?丨丁?iPoiiiipraiwttOl ̄ ̄y?.龜丨..CTZ]?ttd?]T??唇辱??nBRNA1?(\9RNA2?gRNA1?gRNA2?gRNA3?gRNA4??3iiilLuuuuuu??<^RNA3?C\TNA4?初級轉(zhuǎn)錄?纟?RNaseP??JLssl?)Ui.?麵?艦?艦??畢??Cas9?、gRNA1?x?RNA2?JJRNA3?.?gRNA4?Wd]?flRNA??iaL?jLifi.?JLsl.?JLsL??圖1-2?gRNA的兩種表達(dá)策略??左圖是單個RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄每個gRNA
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本文編號:3510765
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