本文關(guān)鍵詞：葡萄抗白粉病相關(guān)基因Mlo的克隆與功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前我國葡萄在生產(chǎn)中還存在很多問題,嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,尤其是主要栽培種歐洲葡萄,其果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良,但抗病性較差。多年研究表明中國野生華東葡萄白河-35-1(Vitis pseudoreticulata accession.Baihe-35-1)對葡萄白粉菌(Erysiphe necator Schw.[syn.Uncinula necator(Schw.)Burr.])呈高抗性。因此,進(jìn)一步研究并分離葡萄抗白粉病基因?qū)ρ芯科咸芽共C(jī)理和利用抗病基因改良?xì)W洲葡萄栽培種有重要價值。本研究在課題組已經(jīng)克隆了抗病的中國野生華東葡萄白河-35-1 VpMlo3、VpMlo6、VpMlo7、VpMlo8、VpMlo11和VpMlo13基因的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步克隆了感病的歐洲葡萄佳利釀VvCMlo3、VvCMlo6、VvCMlo7、VvCMlo11、VvCMlo13基因,研究了感抗葡萄中Mlo基因?qū)Σ≡捻憫?yīng)模式;分析了5個VpMlo基因的亞細(xì)胞定位情況;驗(yàn)證了VpMlo蛋白與CaM蛋白是否互作;鑒定了轉(zhuǎn)VpMlo13基因擬南芥植株對白粉菌的抗性。主要獲得以下研究結(jié)果:1、從感病的歐洲葡萄佳利釀中克隆了VvCMlo3、VvCMlo6、VvCMlo7、VvCMlo11、VvCMlo13基因,獲得的cDNA長度分別為1600bp、1701bp、1690bp、1823bp、1841bp,ORF分別為1329bp、1638bp、1620bp、1752bp、1764bp,分別編碼了442、545、539、583、587個氨基酸。2、通過SMART軟件分析Mlo蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)VvCMlo3、VvCMlo6蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分別比華東葡萄VpMLO3、VpMLO6蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域少一個;華東葡萄VpMlo8基因內(nèi)部提前出現(xiàn)終止子,僅保留了2個跨膜結(jié)構(gòu)域,其余3個Mlo蛋白均由7個跨膜結(jié)構(gòu)域、1個CaMBD結(jié)構(gòu)域和2個保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,并且保守性較強(qiáng)。3、通過實(shí)時熒光定量PCR分析了感抗葡萄中6個Mlo基因在白粉菌誘導(dǎo)后不同時期的表達(dá)量變化,發(fā)現(xiàn)在感抗葡萄中Mlo6、Mlo7基因的表達(dá)模式相似,均在8h響應(yīng)劇烈,并且處理組基因的表達(dá)量是對照組基因表達(dá)量的10倍以上;Mlo11基因在佳利釀葡萄中于8h、72h出現(xiàn)響應(yīng),在白河-35-1葡萄中響應(yīng)不明顯;Mlo13基因在白河-35-1葡萄中于8h、7d出現(xiàn)響應(yīng),在佳利釀葡萄中響應(yīng)不明顯。總體來說Mlo11、Mlo13基因的表達(dá)水平低于Mlo6、Mlo7基因的表達(dá)水平。4、分別構(gòu)建5個VpMlo基因的亞細(xì)胞定位載體,通過PEG方法將pBI221-GFP/VpMlo質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體后,用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光,發(fā)現(xiàn)5個VpMlo基因均定位于細(xì)胞膜上。5、從中國野生華東葡萄白河-35-1中克隆了CaM基因,ORF全長為450bp,編碼149個氨基酸。分別構(gòu)建5個VpMlo基因的BD誘餌載體和CaM基因的AD載體,并通過酵母雙雜交方法驗(yàn)證了VpMlo蛋白與CaM蛋白是否互作,結(jié)果表明VpMlo7蛋白與CaM蛋白互作。6、轉(zhuǎn)VpMlo13基因的三突擬南芥植株經(jīng)白粉菌處理后,通過臺盼藍(lán)染色顯微鏡觀察孢子萌發(fā)及菌絲的生長情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)VpMlo13基因的三突擬南芥植株恢復(fù)了對白粉菌的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：華東葡萄白河-35-1 歐洲葡萄佳利釀 Mlo基因 白粉菌 功能驗(yàn)證
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.631.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-16
• 1.1 植物的免疫抗病機(jī)制12-13
• 1.2 Mlo基因的研究進(jìn)展13-15
• 1.2.1 Mlo基因的概況13-14
• 1.2.2 Mlo基因功能研究14-15
• 1.3 研究目的和意義15-16
• 第二章 材料和方法16-24
• 2.1 試驗(yàn)材料16-17
• 2.1.1 植物材料16
• 2.1.2 質(zhì)粒載體與菌株16
• 2.1.3 主要試劑16
• 2.1.4 培養(yǎng)基與試劑配制16-17
• 2.2 試驗(yàn)方法17-24
• 2.2.1 葡萄葉片人工接種白粉菌處理與觀察17
• 2.2.2 葡萄葉片總RNA的提取及cDNA的合成17
• 2.2.3 歐洲葡萄佳利釀抗白粉病相關(guān)基因VvCMlo的克隆17-18
• 2.2.4 歐洲葡萄佳利釀VvCMlo基因在白粉菌誘導(dǎo)后不同時期的表達(dá)量分析18-19
• 2.2.5 亞細(xì)胞定位19-21
• 2.2.6 酵母雙雜交驗(yàn)證21-23
• 2.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株人工接種白粉菌處理與觀察23-24
• 第三章 結(jié)果與分析24-42
• 3.1 葡萄抗白粉病相關(guān)基因Mlo的克隆與序列分析24-29
• 3.1.1 歐洲葡萄佳利釀接種白粉菌后鏡檢觀察24-25
• 3.1.2 歐洲感病葡萄佳利釀抗白粉病相關(guān)基因Mlo的克隆25
• 3.1.3 葡萄抗白粉病相關(guān)基因Mlo的序列分析25-29
• 3.2 葡萄抗白粉病相關(guān)基因Mlo的表達(dá)分析29-32
• 3.2.1 白粉菌接種后不同時期內(nèi)VvCMlo基因表達(dá)量的變化29-30
• 3.2.2 VvCMlo基因與VpMLO基因的處理組與對照組相對表達(dá)量比值的差異分析30-32
• 3.3 中國野生華東葡萄白河351VpMlo基因的亞細(xì)胞定位分析32-35
• 3.4 中國野生華東葡萄白河351VpMlo蛋白與CaM蛋白互作的驗(yàn)證35-40
• 3.4.1 VpMlo基因誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建35-37
• 3.4.2 誘餌表達(dá)載體自激活驗(yàn)證37
• 3.4.3 CaM基因pGADT7載體的構(gòu)建37-39
• 3.4.4 中國野生華東葡萄白河351VpMlo蛋白與CaM蛋白互作的驗(yàn)證39-40
• 3.5 轉(zhuǎn)VpMlo13基因擬南芥植株的抗病性分析40-42
• 第四章 討論42-46
• 4.1 葡萄Mlo基因序列變異42-43
• 4.2 葡萄Mlo基因參與植株抗病反應(yīng)43-44
• 4.3 中國野生華東葡萄白河351VpMlo蛋白與CaM蛋白相互作用44-45
• 4.4 轉(zhuǎn)VpMlo13基因擬南芥植株的抗病性研究45-46
• 第五章 結(jié)論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 致謝53-54
• 作者簡介54

  本文關(guān)鍵詞：葡萄抗白粉病相關(guān)基因Mlo的克隆與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：351057