黃花苜蓿（Medicago falcata）在耐冷、耐鹽和抗旱等方面具有突出的抗逆特性,是進(jìn)行豆科牧草品種改良的優(yōu)異種質(zhì)資源和重要基因庫(kù)。許多研究表明,NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究以實(shí)驗(yàn)室已從黃花苜蓿中克隆獲得的1個(gè)cDNA序列為基礎(chǔ),推導(dǎo)其為編碼206個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),而其9-142位氨基酸序列為公認(rèn)的NAM結(jié)構(gòu)域,且該蛋白與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtNAC34的同源性最高。因此,本研究將該cDNA序列命名為MfNAC34基因。MfNAC34的分子量為23.52kDa,理論等電點(diǎn)為4.24。生物信息學(xué)分析及預(yù)測(cè)顯示:MfNAC34是無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域且定位在細(xì)胞核內(nèi)的親水性蛋白。煙草（Nicotiana Benthamiana）表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)MfNAC34-sGFP融合蛋白,激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證MfNAC34定位于細(xì)胞核內(nèi)。酵母AH109細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MfNAC34具有轉(zhuǎn)錄激活功能,且轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于蛋白的C端。MfNAC34基因在黃花苜蓿莖中的表達(dá)最大,且NaCl、山梨醇和0℃脅迫均可... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

載體pGBKT7-DBD-MfNAC34（c）示意圖

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文142.2.4MfNAC34亞細(xì)胞定位驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MfNAC34定位在細(xì)胞核內(nèi)的分析結(jié)果，本研究構(gòu)建了pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）瞬時(shí)表達(dá)載體（如圖2.2）。MfNAC34蛋白與GFP蛋白融合表達(dá)，利用GFP蛋白自發(fā)綠色熒光的特點(diǎn)，可對(duì)MfNAC34進(jìn)行亞細(xì)胞定位。（1）構(gòu)建pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）融合表達(dá)載體依據(jù)已有的完整ORF序列的目的片段與pCAMBIA1300(35S-sGFP)載體序列，設(shè)計(jì)特異性引物pCAMMfNAC34-R和pCAMMfNAC34-F（表2.2），以pMD19-T-MfNAC34質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增不含有終止密碼子的MfNAC34全長(zhǎng)ORF序列。PCR反應(yīng)體系同2.2.3（1）。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，58℃退火40S，72℃延伸40S，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，15℃30min。PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)KpnⅠ和SalⅠ酶切，獲得MfNAC34基因酶切片段，酶切體系如下：組分反應(yīng)1反應(yīng)2pCAMBIA1300（35S-sGFP）（200μg/μL）2μL—MfNAC34片段—16μLQuickCutTMKpnⅠ0.5μL1μLQuickCutTMSalⅠ0.5μL1μL10×QuickCutBuffer1μL2μLddH2O6μL—pCAMBIA1300（35S-sGFP）質(zhì)粒經(jīng)酶切后做純化處理，再經(jīng)去磷酸化酶處理后，獲得含有與MfNAC34基因酶切片段相同粘性末端的片段。分別純化經(jīng)酶切獲得的MfNAC34基因酶切片段和經(jīng)酶切后去磷酸化酶處理的pCAMBIA1300（35S-sGFP）質(zhì)粒片段，用T4連接酶連接，構(gòu)建pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）融合表達(dá)載體。連接體系如下：圖2.2重組質(zhì)粒pCAMBIA1300(35S-MfNAC34-sGFP)Fig.2.2ConstructionofthepCAMBIA1300(35S-MfNAC34-sGFP)recombinantplasmid

fNAC34基因擬南芥純合體植株的獲得將T0代擬南芥轉(zhuǎn)化種子表面消毒后，播種在含有40mg/mLGen的1/2MS固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，獲得可以正常發(fā)芽生長(zhǎng)的幼苗。移栽至含有蛭石的營(yíng)養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土與蛭石比例為3:1）中，在相對(duì)濕度60%，16h/8h光照/黑暗的溫室條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)。同時(shí)，采集葉片，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。培養(yǎng)至莢果成熟時(shí)，單株收集獲得T1代種子。將不同轉(zhuǎn)化株系的T1代種子播種在含有40mg/mLGen的1/2MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2周后，選取具有抗性性狀分離比為3:1的株系移栽至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得T2代種子。將圖2.3pPZP221(35S-MfNAC34-NOS)重組質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2.3ConstructionofthepPZP221(35S-MfNAC34-NOS)recombinantplasmid

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]黃花苜蓿MfNAC95基因鑒定及其應(yīng)答鹽脅迫的表達(dá)分析[J]. 張立全,賈旭慧,趙靜瑋,王旌吉,哈斯阿古拉.  中國(guó)草地學(xué)報(bào). 2020(01)
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[3]柳樹(shù)NAC基因的克隆與表達(dá)模式分析[J]. 田雪瑤,周潔,王保松,何開(kāi)躍,何旭東.  南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020(01)
[4]黃花苜蓿MfNAC37基因的克隆及鹽脅迫下的表達(dá)分析[J]. 張立全,賈旭慧,趙靜瑋,劉雨欣,哈斯阿古拉.  中國(guó)草地學(xué)報(bào). 2019(03)
[5]13個(gè)蘋(píng)果NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 李慧峰,董慶龍,趙強(qiáng),冉昆.  植物遺傳資源學(xué)報(bào). 2019(04)
[6]煙草中蛋白激酶基因NtCIPK3的表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)分析[J]. 陳倩,楊尚諭,卓維,李佳皓,彭雙,王靜,李立芹.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2018(06)
[7]紫花苜蓿和黃花苜蓿種子萌發(fā)期對(duì)PEG模擬干旱脅迫的響應(yīng)[J]. 劉佳月,杜建材,王照蘭,崔樂(lè)樂(lè),趙彥慧.  中國(guó)草地學(xué)報(bào). 2018(03)
[8]煙草NAC4基因的克隆及其抗旱功能分析[J]. 代婷婷,姚新轉(zhuǎn),呂立堂,趙德剛.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2018(05)
[9]青花菜轉(zhuǎn)錄因子基因BoNAC1的克隆與表達(dá)分析[J]. 蔣明,張慧娟,張志仙,陳珍,管銘,劉潔,陳孝賞.  核農(nóng)學(xué)報(bào). 2018(04)
[10]三七NAC轉(zhuǎn)錄因子基因PnNAC1的克隆及表達(dá)特性分析[J]. 王國(guó)東,李金晶,白智偉,關(guān)瑞攀,楊野,曲媛,崔秀明,劉迪秋.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2017(04)

博士論文
[1]蘋(píng)果NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控干旱脅迫響應(yīng)和矮化性狀的研究[D]. 賈東峰.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2019
[2]黃花苜蓿MfNAC3、MfNAC4分別參與低溫和鹽脅迫的分子機(jī)制初探[D]. 曲悅婷.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]鷹嘴豆NAC轉(zhuǎn)錄因子CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2參與逆境脅迫響應(yīng)的功能分析[D]. 于興旺.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[4]黃花苜蓿非生物脅迫數(shù)據(jù)挖掘與系統(tǒng)分析[D]. 苗震龑.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[5]中國(guó)黃花苜蓿野生種質(zhì)資源研究[D]. 王俊杰.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008

碩士論文
[1]黃花苜蓿MfNAC35基因的功能分析[D]. 常娜.內(nèi)蒙古大學(xué) 2018
[2]紫花苜蓿與黃花苜�？购缔D(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D]. 劉佳月.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2018
[3]低溫脅迫下黃花苜蓿蛋白質(zhì)組的初步分析[D]. 王楠.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2008
[4]黃花苜蓿抗旱、耐鹽生理特性及其抗性機(jī)理的初步研究[D]. 呂世杰.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[5]黃花苜蓿幼苗抗旱性及遺傳多樣性研究[D]. 王赫.東北師范大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3500350