黃花苜蓿（Medicago falcata）在耐冷、耐鹽和抗旱等方面具有突出的抗逆特性,是進行豆科牧草品種改良的優(yōu)異種質資源和重要基因庫。許多研究表明,NAC轉錄因子家族在調控植物生長發(fā)育以及逆境應答過程中發(fā)揮重要作用。本研究以實驗室已從黃花苜蓿中克隆獲得的1個cDNA序列為基礎,推導其為編碼206個氨基酸的蛋白質,而其9-142位氨基酸序列為公認的NAM結構域,且該蛋白與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtNAC34的同源性最高。因此,本研究將該cDNA序列命名為MfNAC34基因。MfNAC34的分子量為23.52kDa,理論等電點為4.24。生物信息學分析及預測顯示:MfNAC34是無信號肽和跨膜結構域且定位在細胞核內的親水性蛋白。煙草（Nicotiana Benthamiana）表皮細胞瞬時表達MfNAC34-sGFP融合蛋白,激光共聚焦顯微鏡觀測結果進一步驗證MfNAC34定位于細胞核內。酵母AH109細胞轉化實驗驗證了MfNAC34具有轉錄激活功能,且轉錄激活結構域位于蛋白的C端。MfNAC34基因在黃花苜蓿莖中的表達最大,且NaCl、山梨醇和0℃脅迫均可... 

【文章來源】：內蒙古大學內蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

載體pGBKT7-DBD-MfNAC34（c）示意圖

內蒙古大學碩士學位論文142.2.4MfNAC34亞細胞定位驗證為了進一步驗證生物信息學預測MfNAC34定位在細胞核內的分析結果，本研究構建了pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）瞬時表達載體（如圖2.2）。MfNAC34蛋白與GFP蛋白融合表達，利用GFP蛋白自發(fā)綠色熒光的特點，可對MfNAC34進行亞細胞定位。（1）構建pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）融合表達載體依據(jù)已有的完整ORF序列的目的片段與pCAMBIA1300(35S-sGFP)載體序列，設計特異性引物pCAMMfNAC34-R和pCAMMfNAC34-F（表2.2），以pMD19-T-MfNAC34質粒為模板，進行PCR反應擴增不含有終止密碼子的MfNAC34全長ORF序列。PCR反應體系同2.2.3（1）。PCR反應條件為95℃預變性5min；95℃變性1min，58℃退火40S，72℃延伸40S，30個循環(huán)；72℃10min，15℃30min。PCR產物純化后，經KpnⅠ和SalⅠ酶切，獲得MfNAC34基因酶切片段，酶切體系如下：組分反應1反應2pCAMBIA1300（35S-sGFP）（200μg/μL）2μL—MfNAC34片段—16μLQuickCutTMKpnⅠ0.5μL1μLQuickCutTMSalⅠ0.5μL1μL10×QuickCutBuffer1μL2μLddH2O6μL—pCAMBIA1300（35S-sGFP）質粒經酶切后做純化處理，再經去磷酸化酶處理后，獲得含有與MfNAC34基因酶切片段相同粘性末端的片段。分別純化經酶切獲得的MfNAC34基因酶切片段和經酶切后去磷酸化酶處理的pCAMBIA1300（35S-sGFP）質粒片段，用T4連接酶連接，構建pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）融合表達載體。連接體系如下：圖2.2重組質粒pCAMBIA1300(35S-MfNAC34-sGFP)Fig.2.2ConstructionofthepCAMBIA1300(35S-MfNAC34-sGFP)recombinantplasmid

fNAC34基因擬南芥純合體植株的獲得將T0代擬南芥轉化種子表面消毒后，播種在含有40mg/mLGen的1/2MS固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，獲得可以正常發(fā)芽生長的幼苗。移栽至含有蛭石的營養(yǎng)土（營養(yǎng)土與蛭石比例為3:1）中，在相對濕度60%，16h/8h光照/黑暗的溫室條件下培養(yǎng)生長。同時，采集葉片，提取DNA，進行PCR擴增鑒定。培養(yǎng)至莢果成熟時，單株收集獲得T1代種子。將不同轉化株系的T1代種子播種在含有40mg/mLGen的1/2MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2周后，選取具有抗性性狀分離比為3:1的株系移栽至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得T2代種子。將圖2.3pPZP221(35S-MfNAC34-NOS)重組質粒構建Fig.2.3ConstructionofthepPZP221(35S-MfNAC34-NOS)recombinantplasmid

【參考文獻】：
期刊論文
[1]黃花苜蓿MfNAC95基因鑒定及其應答鹽脅迫的表達分析[J]. 張立全,賈旭慧,趙靜瑋,王旌吉,哈斯阿古拉.  中國草地學報. 2020(01)
[2]不同鹽分對黃花苜蓿早期幼苗生長及離子積累的影響[J]. 武祎,田雨,宋彥濤.  中國草地學報. 2019(04)
[3]柳樹NAC基因的克隆與表達模式分析[J]. 田雪瑤,周潔,王保松,何開躍,何旭東.  南京林業(yè)大學學報(自然科學版). 2020(01)
[4]黃花苜蓿MfNAC37基因的克隆及鹽脅迫下的表達分析[J]. 張立全,賈旭慧,趙靜瑋,劉雨欣,哈斯阿古拉.  中國草地學報. 2019(03)
[5]13個蘋果NAC轉錄因子基因的克隆與表達分析[J]. 李慧峰,董慶龍,趙強,冉昆.  植物遺傳資源學報. 2019(04)
[6]煙草中蛋白激酶基因NtCIPK3的表達載體構建及表達分析[J]. 陳倩,楊尚諭,卓維,李佳皓,彭雙,王靜,李立芹.  華北農學報. 2018(06)
[7]紫花苜蓿和黃花苜蓿種子萌發(fā)期對PEG模擬干旱脅迫的響應[J]. 劉佳月,杜建材,王照蘭,崔樂樂,趙彥慧.  中國草地學報. 2018(03)
[8]煙草NAC4基因的克隆及其抗旱功能分析[J]. 代婷婷,姚新轉,呂立堂,趙德剛.  農業(yè)生物技術學報. 2018(05)
[9]青花菜轉錄因子基因BoNAC1的克隆與表達分析[J]. 蔣明,張慧娟,張志仙,陳珍,管銘,劉潔,陳孝賞.  核農學報. 2018(04)
[10]三七NAC轉錄因子基因PnNAC1的克隆及表達特性分析[J]. 王國東,李金晶,白智偉,關瑞攀,楊野,曲媛,崔秀明,劉迪秋.  華北農學報. 2017(04)

博士論文
[1]蘋果NAC轉錄因子調控干旱脅迫響應和矮化性狀的研究[D]. 賈東峰.西北農林科技大學 2019
[2]黃花苜蓿MfNAC3、MfNAC4分別參與低溫和鹽脅迫的分子機制初探[D]. 曲悅婷.中國農業(yè)大學 2016
[3]鷹嘴豆NAC轉錄因子CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2參與逆境脅迫響應的功能分析[D]. 于興旺.南京農業(yè)大學 2014
[4]黃花苜蓿非生物脅迫數(shù)據(jù)挖掘與系統(tǒng)分析[D]. 苗震龑.中國農業(yè)大學 2014
[5]中國黃花苜蓿野生種質資源研究[D]. 王俊杰.內蒙古農業(yè)大學 2008

碩士論文
[1]黃花苜蓿MfNAC35基因的功能分析[D]. 常娜.內蒙古大學 2018
[2]紫花苜蓿與黃花苜�？购缔D錄組學研究[D]. 劉佳月.中國農業(yè)科學院 2018
[3]低溫脅迫下黃花苜蓿蛋白質組的初步分析[D]. 王楠.中國農業(yè)科學院 2008
[4]黃花苜蓿抗旱、耐鹽生理特性及其抗性機理的初步研究[D]. 呂世杰.內蒙古農業(yè)大學 2007
[5]黃花苜蓿幼苗抗旱性及遺傳多樣性研究[D]. 王赫.東北師范大學 2006



本文編號：3500350