小麥莖基腐病是一種由多種病原菌引起世界性的土傳病害,主要病原菌有假禾谷鐮刀菌、禾谷鐮刀菌及黃色鐮刀菌等,在澳大利亞、美國等地假禾谷鐮刀菌是引起小麥莖基腐病的主要病原。我國黃淮麥區(qū)近年小麥莖基腐病的發(fā)生日益嚴(yán)重,研究發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮刀菌是引起該病害的主要病原之一。目前對(duì)假禾谷鐮刀菌的研究大多停留在形態(tài)、分類及遺傳多樣性等層面,對(duì)其致病的分子機(jī)理研究還比較匱乏。甘露糖轉(zhuǎn)移酶是參與蛋白N-糖基化的重要酶,以往的研究顯示,蛋白糖基化對(duì)病原真菌的菌絲生長、繁殖和發(fā)育過程具有關(guān)鍵的調(diào)控作用,這些糖基化的關(guān)鍵基因在病原真菌的致病過程中起著必不可少的作用。本論文探索從蛋白的N-糖基化方面揭示假禾谷鐮刀菌侵染過程的分子機(jī)制。根據(jù)假禾谷鐮刀菌侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)關(guān)于甘露糖轉(zhuǎn)移酶修飾分泌蛋白N端甘露糖基化途徑的一個(gè)同源基因FpALG3差異表達(dá),通過其中的數(shù)據(jù)得到FpALG3基因含有1409個(gè)核苷酸,有2個(gè)內(nèi)含子,編碼432個(gè)氨基酸。所以選擇了α-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因作為本研究的重點(diǎn)。采用反向遺傳學(xué)的研究思路,通過基因敲除技術(shù)獲得了抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子。用四對(duì)引物對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測篩選,然... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

Fpg（多發(fā)于半干旱氣候區(qū)）和Fg（濕潤氣候）的生活史[23]

質(zhì)粒的提取作步驟詳見 SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提（生工）試劑盒說明書。 假禾谷鐮刀菌 FpALG3 基因同源重組序列的構(gòu)建.1 目的基因敲除引物的設(shè)計(jì)據(jù) FpALG3 基因序列在基因組數(shù)據(jù)庫中找到其上下各 5000bp 的核苷酸序列，結(jié)合酸轉(zhuǎn)移酶基因（Hph）序列用軟件 Primer Premer 6.0 和 DNAMAN 來設(shè)計(jì)用于 Sper PCR 敲除策略（圖 3）的引物和檢測引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，詳見表 1。其中引物 R1有與 Hph 基因兩端同源的尾巴。

圖 4 Bsp1407I 酶切示意圖Fig 4. Schematic diagram of the Bsp1407I restriction野生型和轉(zhuǎn)化子基因組 DNA 的酶切、電泳：分析 FpALG3 基因及其上下 3000bp 和 H因的酶切位點(diǎn)，選擇在 FpALG3 基因和 Hph 基因內(nèi)部中不存在，且在 FpALG3 基因上000bp 左右存在的酶切位點(diǎn)，最終選擇了 Bsp1407I（酶切位點(diǎn)是 T/GTACA），位于基因密碼子上游 2.2kb 和終止密碼子下游 0.4kb 處，見圖 4。酶切體系為：DNA 100μl10×buffer 20μlBsp1407 I 5μlddH2O 55μl酶切過夜 24h，消化結(jié)束時(shí)可取 1μl 用于電泳檢測，消化效果以電泳帶彌散在整條泳為最適。濃縮 DNA，最終溶解于 25μl ddH2O；濃縮后的 DNA 樣品中加入 5μl 6×Loadiuffer，混勻后上樣于 0.8%的瓊脂糖凝膠，在 35V 電壓下電泳 6h 左右。電泳完畢后，將 Southern Blot 雜交，整個(gè)雜交過程詳見王光輝碩士學(xué)位畢業(yè)論文[121]。雜交探針的設(shè)計(jì)：分別在目的基因和潮霉素基因內(nèi)部設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的雜交探針。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[2]小麥莖基腐病藥劑防治技術(shù)研究[D]. 牛亞娟.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]黃淮麥區(qū)小麥莖基腐病病原鑒定及其致病性研究[D]. 周海峰.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[4]禾谷鐮刀菌AMT1基因的功能研究[D]. 王光輝.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3499309