本文關(guān)鍵詞：小菜蛾中腸Polycalin基因克隆及其功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小菜蛾P(guān)lutella xylostella(Linnaeus)是一種世界性范圍內(nèi)廣泛分布的十字花科蔬菜重要害蟲。無公害Bt(Bacillus thuringiensis)生物農(nóng)藥的使用和轉(zhuǎn)Bt基因作物的大規(guī)模種植,對小菜蛾的危害起到了一定的控制作用,但由于害蟲長期處于Bt毒素蛋白的高壓選擇下,害蟲對Bt產(chǎn)生抗性的潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視,小菜蛾成為最早在田間發(fā)現(xiàn)對Bt產(chǎn)生抗性的害蟲。Bt毒素的作用機(jī)理是與昆蟲中腸上的刷狀緣膜蛋白(Brush border membrane vesicles,BBMV)受體結(jié)合,形成寡聚化的結(jié)構(gòu),在中腸細(xì)胞膜上形成穿孔,導(dǎo)致昆蟲死亡。可見,昆蟲中腸受體蛋白在Bt毒素發(fā)揮效力中起著至關(guān)重要的作用。昆蟲中腸Bt毒素的受體主要有氨肽酶、鈣粘蛋白和堿性磷酸脂酶等,已有報(bào)道表明在家蠶、棉鈴蟲等昆蟲的中腸中存在Polycalin蛋白,該蛋白也是與Bt毒素能結(jié)合的新的受體,但在小菜蛾中腸中未見研究報(bào)道。本研究以陜西楊凌地區(qū)對Bt毒素敏感的小菜蛾為研究對象,采用分子生物學(xué)技術(shù)對小菜蛾中腸Polycalin基因進(jìn)行克隆。通過熒光定量分析了該基因在小菜蛾不同發(fā)育時(shí)期,幼蟲不同部位的表達(dá)量。運(yùn)用生物測定方法測定了Bt Cry1Ac毒素蛋白對小菜蛾的毒力,比較了小菜蛾取食不同濃度Cry1Ac毒素后Polycalin基因的表達(dá)量。運(yùn)用蛋白質(zhì)研究技術(shù),通過合成多肽,制備Polycalin蛋白抗體,提取小菜蛾中腸受體BBMV蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,運(yùn)用Western blot和Ligand blot的方法檢測了Polycalin蛋白在小菜蛾中腸上的存在及其與Cry1Ac的結(jié)合特性,明確其蛋白功能。主要研究結(jié)果如下:1.通過PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆獲得了小菜蛾P(guān)olycalin基因的全長序列,該基因全長為9102 bp,開放閱讀框?yàn)?778 bp,編碼2925個(gè)氨基酸,預(yù)測蛋白的等電點(diǎn)和分子量分別為4.39和326.38 kDa。推導(dǎo)的氨基酸序列中,N末端含有20個(gè)氨基酸組成的信號肽,含有67個(gè)O-糖基化位點(diǎn),14個(gè)N-糖基化位點(diǎn),7個(gè)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白位點(diǎn),氨基酸序列具有典型的中腸受體蛋白的特征,即2個(gè)GPI結(jié)合位點(diǎn)。小菜蛾P(guān)olycalin基因與已報(bào)道的其他昆蟲的氨基酸序列比對,一致性為35.9%-50.5%。2.通過Real-time PCR技術(shù)檢測了Polycalin基因的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)Polycalin基因在小菜蛾各個(gè)發(fā)育階段均可以表達(dá),幼蟲期表達(dá)量遠(yuǎn)高于蛹期和成蟲期,其中以3齡幼蟲表達(dá)量最高,成蟲期表達(dá)量最低。同時(shí)比較了小菜蛾幼蟲頭部、胸部和腹部Polycalin基因表達(dá)情況,結(jié)果表明Polycalin在腹部表達(dá)量最高,頭部和胸部表達(dá)量較低。3.給小菜蛾3齡幼蟲飼喂不同濃度的Bt Cry1Ac毒素蛋白,運(yùn)用生物測定技術(shù)測定了毒素對小菜蛾的致死作用,獲得毒力方程為y=-2.125+0.838x,LC50為343.5 ng/ml。4.通過Real-time PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)小菜蛾3齡幼蟲取食活化的不同濃度Bt Cry1Ac毒素蛋白后,Polycalin基因的表達(dá)量下降,但隨著取食時(shí)間的延長,小菜蛾P(guān)olycalin的表達(dá)量逐漸恢復(fù)。5.根據(jù)克隆獲得的Polycalin基因序列,通過合成多肽技術(shù),制備了Polycalin蛋白抗體。對提取的小菜蛾中腸受體BBMV蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,運(yùn)用Western blot技術(shù),可以檢測到中腸BBMV蛋白中有一個(gè)約300 kDa的條帶可以與Polycalin蛋白抗體結(jié)合,說明中腸上確實(shí)存在Polycalin蛋白。6.對提取的小菜蛾中腸受體BBMV蛋白,通過Ligand blot方法,運(yùn)用Bt Cry1Ac活化毒素及其抗體檢測,發(fā)現(xiàn)這個(gè)約300 kDa的Polycalin蛋白條帶可以與Bt Cry1Ac活化毒素結(jié)合。通過以上各方面的研究,發(fā)現(xiàn)小菜蛾中腸確實(shí)存在Polycalin基因,而且該基因表達(dá)的蛋白可以與Bt毒素結(jié)合,具有受體功能。
【關(guān)鍵詞】：小菜蛾 Polycalin Bt 克隆 功能分析
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-24
• 1.1 引言13
• 1.2 Bt的研究進(jìn)展13-17
• 1.2.1 Bt概述13-14
• 1.2.2 Bt毒素的結(jié)構(gòu)和功能14-15
• 1.2.3 Bt毒蛋白的作用機(jī)制15-17
• 1.3 昆蟲中腸Bt受體蛋白的研究17-18
• 1.4 Bt應(yīng)用進(jìn)展及抗性研究現(xiàn)狀18-21
• 1.4.1 Bt應(yīng)用進(jìn)展18-19
• 1.4.2 Bt抗性機(jī)制19-21
• 1.5 小菜蛾Bt抗性的研究進(jìn)展21
• 1.6 本研究的目的與意義21-22
• 1.7 研究內(nèi)容22-23
• 1.8 技術(shù)路線23-24
• 第二章 Polycalin基因克隆24-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 2.1.1 供試?yán)ハx24
• 2.1.2 主要試劑24
• 2.1.3 主要儀器24-25
• 2.1.4 培養(yǎng)基及試劑的配制25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-33
• 2.2.1 總RNA的提取25-26
• 2.2.2 cDNA的合成26-27
• 2.2.3 5'RACE和 3'RACE cDNA模板的制備27-28
• 2.2.4 引物的設(shè)計(jì)28-29
• 2.2.5 PCR反應(yīng)體系和程序29-31
• 2.2.6 PCR產(chǎn)物回收與純化31
• 2.2.7 連接反應(yīng)31-32
• 2.2.8 轉(zhuǎn)化32
• 2.2.9 陽性克隆的鑒定32-33
• 2.2.10 序列分析33
• 2.3 結(jié)果與分析33-42
• 2.3.1 小菜蛾總RNA提取33-34
• 2.3.2 普通PCR和RACE PCR結(jié)果34-35
• 2.3.3 Polycalin基因的序列分析35-39
• 2.3.4 序列同源性分析39-42
• 2.3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析42
• 2.4 結(jié)論與討論42-44
• 第三章 小菜蛾P(guān)olycalin基因的時(shí)空表達(dá)44-51
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料44
• 3.1.1 供試?yán)ハx44
• 3.1.2 主要試劑和儀器44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 3.2.1 小菜蛾不同發(fā)育階段樣品收集44
• 3.2.2 小菜蛾幼蟲不同部位樣品收集44
• 3.2.3 RNA的提取44
• 3.2.4 cDNA第一鏈的合成44-45
• 3.2.5 引物設(shè)計(jì)與合成45
• 3.2.6 qPCR反應(yīng)45-46
• 3.2.7 引物擴(kuò)增效率檢測46
• 3.2.8 數(shù)據(jù)處理46
• 3.3 結(jié)果與分析46-49
• 3.3.1 引物的特異性和擴(kuò)增效率46-48
• 3.3.2 Polycalin基因在小菜蛾不同發(fā)育階段的表達(dá)48
• 3.3.3 Polycalin基因在小菜蛾幼蟲不同部位的表達(dá)分析48-49
• 3.4 結(jié)論與討論49-51
• 第四章 小菜蛾取食Cry1Ac毒素后Polycalin基因的表達(dá)量51-56
• 4.1 材料與方法51-52
• 4.1.1 供試?yán)ハx及試劑51
• 4.1.2 Cry1Ac殺蟲蛋白對小菜蛾的毒力測定51
• 4.1.3 收集取食不同濃度的Cry1Ac毒素小菜蛾樣品51-52
• 4.1.4 小菜蛾幼蟲RNA的提取及cDNA第一鏈的合成52
• 4.1.5 實(shí)時(shí)熒光定量檢測52
• 4.1.6 數(shù)據(jù)處理52
• 4.2 結(jié)果與分析52-53
• 4.2.1 Cry1Ac毒素蛋白對小菜蛾幼蟲的致死效果52
• 4.2.2 小菜蛾取食不同濃度的Cry1Ac毒素后Polycalin基因的表達(dá)量52-53
• 4.3 結(jié)論與討論53-56
• 第五章 小菜蛾中腸Polycalin蛋白的功能分析56-65
• 5.1 材料與方法56-59
• 5.1.1 供試?yán)ハx56
• 5.1.2 主要試劑56
• 5.1.3 主要儀器56
• 5.1.4 試劑配制56-59
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 5.2.1 小菜蛾幼蟲中腸受體蛋白BBMV的提取59
• 5.2.2 BBMV蛋白濃度測定59
• 5.2.3 BBMV蛋白的SDS-PAGE電泳分離59-60
• 5.2.4 Polycalin蛋白抗體的制備60
• 5.2.5 Polycalin蛋白的Western blot檢測60
• 5.2.6 Polycalin蛋白的Ligand blot檢測60-61
• 5.3 結(jié)果與分析61-62
• 5.3.1 小菜蛾中腸BBMV蛋白的SDS-PAGE分離結(jié)果61
• 5.3.2 Polycalin蛋白的Western blot檢測結(jié)果61-62
• 5.3.3 Polycalin蛋白的Ligand blot檢測結(jié)果62
• 5.4 結(jié)論與討論62-65
• 第六章 全文總結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-75
• 致謝75-76
• 作者簡介76

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