發(fā)布時間：2017-05-07 07:04

  本文關鍵詞：慢病毒介導氧化低密度脂蛋白受體基因沉默細胞株的構建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:建立體外LOX-1基因沉默細胞模型,用于探討LOX-1與相關配體在細胞膜表面的相互作用,為研究LOX-1受體在早期動脈粥樣硬化中的作用奠定基礎。方法:以J774a.1細胞的總RNA為模板,通過PCR方法擴增得到LOX-1基因,并亞克隆至psi CHECK2載體上。設計得到LOX-1的sh RNA,并克隆至慢病毒基因沉默載體中,通過雙熒光素酶報告基因篩選得到有效的LOX-1沉默sh RNA。將慢病毒包裝質粒通過脂質體轉染法轉染至293T細胞中,進行慢病毒的包裝。病毒懸液經(jīng)過超濾濃縮后,再通過有限稀釋法測定病毒濃縮液的滴度。使用病毒濃縮液對J774a.1細胞進行侵染并通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定沉默的細胞株。最后對穩(wěn)定沉默細胞株進行RT-PCR和Western blot檢測,鑒定LOX-1的基因沉默情況。結果:成功擴增得到LOX-1基因序列并亞克隆至psi CHECK2載體中。設計得到LOX-1基因沉默sh RNA序列,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)篩選得到了有效的sh RNA序列并克隆至慢病毒沉默載體中。通過共轉染的方式成功包裝得到介導LOX-1基因沉默的慢病毒。對重組病毒進行超濾濃縮及滴度測定,其滴度為4×107。之后使用病毒濃縮液侵染J774a.1巨噬細胞,利用puro抗生素篩選獲得穩(wěn)定的沉默細胞株。結論:成功構建了LOX-1穩(wěn)定沉默的J774a.1細胞株,為今后研究LOX-1在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中的作用奠定了基礎。
【關鍵詞】：動脈粥樣硬化 基因沉默 LOX-1
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-16
• 1.1 動脈粥樣硬化發(fā)病機理9-10
• 1.2 LOX-1 在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中的作用10-15
• 1.2.1 LOX-1 的簡介11-12
• 1.2.2 LOX-1 與動脈粥樣硬化早期12-13
• 1.2.3 LOX-1 對巨噬細胞泡沫化的影響13-14
• 1.2.4 LOX-1 與動脈血栓之間的關系14-15
• 1.3 結語15-16
• 第二章 實驗材料與儀器16-19
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 細胞株16
• 2.1.2 質粒16
• 2.1.3 培養(yǎng)基16-17
• 2.1.4 主要試劑和工具酶17
• 2.2 主要儀器17-19
• 第三章 實驗方法19-37
• 3.1 細胞復蘇培養(yǎng)與凍存19-20
• 3.1.1 J774a.1 細胞的培養(yǎng)19-20
• 3.1.2 293T細胞的培養(yǎng)20
• 3.2 psiCHECK~(TM)2-LOX-1 重組載體的構建20-27
• 3.2.1 LOX-1 基因的調取20-23
• 3.2.2 psiCHECK~（TM）2-LOX-1 重組載體的構建23-27
• 3.3 LOX1shRNA—慢病毒載體構建27-29
• 3.3.1 shRNA的合成27
• 3.3.2 LOX1shRNA—慢病毒載體的構建27-28
• 3.3.3 雙熒光素酶報告基因篩選有效shRNA28-29
• 3.4 LOX-1 基因沉默慢病毒的包裝29-31
• 3.4.1 慢病毒的包裝29-30
• 3.4.2 LOX-1 基因沉默慢病毒的濃縮純化30
• 3.4.3 LOX-1 沉默慢病毒的滴度測定30-31
• 3.5 J774a.1-LOX-1 基因穩(wěn)定沉默細胞株的建立31-32
• 3.5.1 測定puro抗性對J774a.1 細胞的有效致死濃度31
• 3.5.2 基因沉默慢病毒對J774a.1 細胞的侵染及穩(wěn)轉細胞株的篩選31-32
• 3.6 LOX-1 基因沉默效果的檢測32-37
• 3.6.1 沉默細胞中LOX-1 的mRNA表達量的檢測32-34
• 3.6.2 Western-blot檢測基因沉默效果34-37
• 第四章 結果與討論37-44
• 4.1 Total RNA純度分析37
• 4.2 LOX-1 基因片段的獲得37-38
• 4.3 菌落PCR及雙酶切方法鑒定目的基因與T載體連接情況38-39
• 4.4 psiCHECK2-LOX-1 的PCR及雙酶切鑒定39-40
• 4.5 LOX-1 的shRNA序列設計及篩選40-41
• 4.5.1 LOX-1 的shRNA序列設計40
• 4.5.2 LOX-1 的shRNA序列的篩選40-41
• 4.6 LOX-1 沉默慢病毒包裝的滴度測定41
• 4.7 RT-PCR檢測LOX-1 的沉默效果41-42
• 4.8 Western blot檢測LOX-1 蛋白表達量42-43
• 4.9 結論43-44
• 參考文獻44-49
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果49-50
• 致謝50

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 ;Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1:protein,ligands,expression and pathophvsiological significance[J];Chinese Medical Journal;2007年05期

2 丁振華;低密度脂蛋白的氧化修飾及其理化、生物學性質的改變[J];國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊);1994年02期

3 陳瑗,周玫;LDL的氧化修飾和氧化修飾LDL的組成和結構變化[J];生物物理學報;1993年02期

  本文關鍵詞：慢病毒介導氧化低密度脂蛋白受體基因沉默細胞株的構建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：349377