發(fā)布時間：2021-11-11 22:06

　　白樺外皮中含有豐富的三萜類產(chǎn)物,具有多種藥理活性,其中白樺脂酸、白樺脂醇類代謝產(chǎn)物擁有抗腫瘤、抗艾滋病的功效。自然情況下,白樺外皮中三萜含量低,而體外合成成本高,因此,利用基因工程技術探索三萜合成與生產(chǎn)的方法尤為重要。轉錄因子以其“多點調控”的方式可以從整體角度對代謝途徑進行調控,進而提高植物中目標代謝產(chǎn)物的含量。本實驗以白樺（BetulaPlatyphllasuk.）為實驗材料,結合實驗室前期篩選的響應MeJA和SA信號的bHLH轉錄因子基因,擬克隆與白樺三萜合成相關的BpbHLH7和BpbHLH8基因全長及其啟動子序列,并進行生物信息學分析;研究了BpbHLH7和BpbHLH8基因時空及非生物脅迫表達模式;同時分別構建了BpbHLH7和BpbHLH8的酵母表達載體及BpbHLH8的植物過表達和干擾載體,對其在白樺和酵母中的表達特性和基因功能進行研究。以期明確BpbHLH7和BpbHLH8轉錄因子在白樺生長發(fā)育及三萜合成調控中的功能,為白樺三萜類物質代謝工程研究提供理論依據(jù)和技術支持。本研究結果如下:1.以白樺組培苗RNA反轉錄的cDNA為模板,應用特異性引物結合RT-PCR技術,克... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－３白樺三萜化合物合成途徑中的關鍵酶［６３］??以基因工程手段，向植物內引入次生代謝關鍵酶基因，可以提高植物中目的產(chǎn)物含??量的積累

形成的二聚體與下游目的基因啟動子區(qū)域中Ｅ－ｂｏｘ結合，從而調控該基因的轉錄??［８５］。與動物相比，植物的ｂＨＬＨ轉錄因子的研究相對來說比較滯后，只有少數(shù)植物??ｂＨＬＨ轉錄因子的功能得到解析。目前為止，分別從擬南芥和水稻中分離鑒定得到了??１５８和１７３個ｂＨＬＨ轉錄因子［８６１，Ｌｉ根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生、內含子／外顯子結構及蛋白構型將??水稻和擬南芥的所有ｂＨＬＨ轉錄因子分成了?２５個家族，又根據(jù)ｂＨＬＨ結構域Ｎ端的序??列特征將水稻和擬南芥的ｂＨＬＨ轉錄因子分成了?４個小組（圖１－５）?［８７］。這些ｂＨＬＨ轉??錄因子在植物對外界環(huán)境的反應和自身生長發(fā)育中起到了重要作用［８＇在干旱條件下，??ｂＨＬＨ轉錄因子Ｊ／ＭＦＣ２對受ＡＢＡ誘導表達的基因起激活作用［８９］；在擬南芥中，當??０６／／ＺＪ／２過表達，植株的滲透脅迫抗性及耐鹽性均得到提高［９（）１；?Ｃｈｉｍｍｕｓａｍｙ１９１１在擬南??芥中鑒定了一個能夠編碼ｂＨＬＨ轉錄因子的基因／ＣＥ／，并發(fā)現(xiàn)當／Ｃ￡／基因的過表達，??植物的抗冷性明顯提升；Ｋｏｎｄｏｕ１９２１的研究結果表明，ｂＨＬＨ家族轉錄因子的缺失??突變體中，植物體胚胎發(fā)育遲緩。同時，ｂＨＬＨ轉錄因子在信號轉導及生物合成中發(fā)揮??重要作用，如ｂＨＬＨ家族的不同成員分別參與了青花素［９３１、黃酮［９４］、色氨酸１９５１、赤霉??素［９６］等的生物合成，也能夠參與調控水稻的ｆｆｘ基因的表達［９７１、擬南芥中的三色分化??［９８］、植物中的光敏色素［９９１和油菜類固醇［＿信號轉導。??

根據(jù)白樺轉錄組數(shù)據(jù)庫中ｂＨＬＨ７基因已知序列的兩端設計特異引物，以白樺總??ＲＮＡ的反轉錄產(chǎn)物為模板，用辦Ｗ／Ｚ／／７－Ｆ／Ｒ為引物進行ＰＣＲ擴增。通過１％瓊脂糖凝??膠電泳檢測到一條約７５０?ｂｐ的特異擴增條帶，如圖２－１。測序結果顯示，ＰＣＲ產(chǎn)物長度??為７４２?ｂｐ，暫命名為ＢｐｂＨＬＨ７。??２＿—??圖２－１?■冊基因全長ＰＣＲ電泳檢測??（注：Ｍ為２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１？２為５ｐＷ／Ｚ／／７基因擴增產(chǎn)物，３￣４為基因擴增產(chǎn)物）??２．２．１．２仰服／／７全長序列生物信息學分析??（１）辦Ｗ／Ｉ／／７基因分子特征分析??以白樺組培苗ＲＮＡ反轉錄ｃＤＮＡ為模板，通過ＲＴ－ＰＣＲ獲得轉錄因子辦Ｗ／ＺＪ／７??基因ｃＤＮＡ為７４２?ｂｐ，應用ＮＣＢＩ的ＯＲＦ?ｆｍｄｅｒ功能對該全長基因的開放閱讀框??（ｏｐｅｎｉｎｇ?ｒｅａｄｉｎｇ?ｆｒａｍｅ，?ＯＲＦ）進行預測，結果顯不其為完整的ＯＲＦ，長為６１８?ｂｐ，編??碼２０５個氨基酸（圖２－２）。利用ＢＬＡＳＴｐ對此ｃＤＮＡ全長序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)該??氨基酸序列與碧桃（戶／％服ｓ＇ｐｍ＇／ｃｏ）未知蛋白（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＸＰ＿００７１９８８６４）相似度為??６４％。??應用ＢＬＡＳＴ中Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?Ｄｏｍａｉｎｓ功能對該基因產(chǎn)物氨基酸序列保守區(qū)域進行預??測，結果如圖２－３，顯示該蛋白質在５？５０?ａａ有螺旋－環(huán)－螺旋的ＤＮＡ

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]白樺鯊烯合酶和鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆及表達特性研究[D]. 張夢巖.東北林業(yè)大學 2016
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[3]干擾人參CS基因的表達對人參三萜成分含量的影響[D]. 何沐陽.吉林大學 2013
[4]溫度和水分對銀杏葉黃酮合成的影響[D]. 郭旭琴.南京林業(yè)大學 2012
[5]誘導子組合對白樺三萜合成調控及MeJA抑制性消減文庫分析[D]. 任春林.東北林業(yè)大學 2012
[6]MeJA和SA對白樺幼樹三萜合成調控及FPS基因克隆[D]. 李春曉.東北林業(yè)大學 2012
[7]三七三萜皂甙合成途徑鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆及初步表達[D]. 李珅.廣西醫(yī)科大學 2006



本文編號：3489616