由柑桔衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）引起的柑桔衰退病是一種柑桔產(chǎn)業(yè)重要的經(jīng)濟性病害,已經(jīng)造成至少上億株柑橘植物的死亡。在田間,由于嫁接等農(nóng)事操作和蚜蟲的傳播,柑桔衰退病引起快速死亡和莖陷點等癥狀,使得果實小,產(chǎn)量低,從而造成巨大的經(jīng)濟損失。柑桔衰退病具有復(fù)雜的株系分化和遺傳多樣性等特點,傳統(tǒng)的檢測方法難以獲得病毒的全序列。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)克服了這些障礙,可應(yīng)用與柑桔衰退病以及其他未知病毒的檢測與鑒定。本研究對柑桔衰退病枳分離株進行了高通量測序鑒定,對測序的結(jié)果進行RT-PCR驗證,對獲得的數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析,以期獲得該CTV枳分離株的全序列,明確其基因型和在遺傳進化中的關(guān)系,為后續(xù)基于全序列的研究奠定基礎(chǔ),其結(jié)果如下:1.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果:對轉(zhuǎn)錄組測序獲得的reads（>200 nt）去除來源于寄主的片段后進行拼接,結(jié)果表明柑桔衰退病枳分離株中與病毒相關(guān)的contigs僅與兩個CTV分離株具有較高的同源性,通過BLAXTx比對發(fā)現(xiàn)contig14與SY568（AF001623）同源性為87%,contig15與T36（EU937521）的同源性為8... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

測序流程圖

第 3 章 柑橘衰退病毒新基因型鑒定dNTPs 和 DNA polymerase I 等試劑合成雙鏈 cDNAads 純化雙鏈 cDNA。然后純化的雙鏈 cDNA 再進行末接頭，再用 AMPure XP beads 對片段大小進行選擇，擴增得到最終的 cDNA 文庫。 3.0 對構(gòu)建完成的文庫先進行初步定量，然后使用 Agi文庫的片段大小進行平均分子長度檢測，插入片段檢棟梁 PCR 方法對構(gòu)建的文庫的有效濃度進行進一步的的質(zhì)量。文庫構(gòu)建流程圖如下：

Contig15 19288 Citrus tristeza virus strainT360.0 89% EU937521根 據(jù) 拼 接 后 得 到 的 病 毒 contigs 設(shè) 計 檢 測 引 物 ， L1J-F(5’-TCTTCTTTCGCTTCCGTG-3’) / L1J-R (5’-GCACATTCCAAGTCAGTCAA -3’)和 M1J-F (5’-ACGATGTGCGTCAGTTAGG-3’) / M1J-R(5’-TCCAGTCAAGAAATCCGC -3’)，參照本章中的 RT-PCR 的方法成功證明了這兩個 CTV 枳分離株存在于枳中。3.3.2 全基因組序列的擴增以提取的樣品枳殼葉片總 RNA 為模板，根據(jù)高通量測序獲得的 contigs 設(shè)計擴增引物（表 3.1），利用分段 RT-PCR 和 RACE-PCR 進行擴增，利用 SeqMan對測序結(jié)果進行拼接，獲得 2 個不同 CTV 分離株的全基因組，并分別命名為CN-L1-ZT1 和 CN-M1-ZT1。MCN-L1-ZT1 CN-M1-ZT1

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3483045