發(fā)布時間：2021-11-05 18:17

　　目的:以攜帶牙骨質(zhì)蛋白1（cementum protein 1,CEMP1）基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）并構(gòu)建細(xì)胞膜片,探討CEMP1基因修飾的BMSCs細(xì)胞膜片對骨質(zhì)疏松狀態(tài)下牙周組織再生的作用。方法:1.全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面標(biāo)志物,經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)后觀察細(xì)胞的多向分化能力。2.使用維生素C連續(xù)誘導(dǎo)法構(gòu)建BMSCs細(xì)胞膜片,通過組織學(xué)染色以及掃描電鏡觀察膜片的結(jié)構(gòu)。使用免疫熒光染色檢測膜片胞外基質(zhì)Ι型膠原（collagen typeΙ,Col-Ι）、骨膜蛋白（periostin,PN）和纖維連接蛋白（fibronectin,FN）的表達(dá)。3.使用攜帶CEMP1基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs并構(gòu)建細(xì)胞膜片,流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后BMSCs膜片中CEMP1基因和蛋白的表達(dá)。4.采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)構(gòu)建大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（postmenopausal osteoporosis,PMO... 

【文章來源】：福建醫(yī)科大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

大鼠BMSCs體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察A：BMSCs原代培養(yǎng)5d；B：BMSCs原代培養(yǎng)10d；標(biāo)尺：500μm

17圖1-2BMSCs多向分化能力檢測A：BMSCs成骨誘導(dǎo)顯微鏡下觀；B：BMSCs成脂誘導(dǎo)顯微鏡下觀；C：BMSCs成骨誘導(dǎo)顯微鏡下觀；D：BMSCs成骨誘導(dǎo)礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色；E：BMSCs成脂誘導(dǎo)脂滴油紅O染色；F：BMSCs成骨誘導(dǎo)ALP染色；標(biāo)尺：300μm。3.BMSCs表面標(biāo)志物檢測使用流式細(xì)胞儀對BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD31、CD45、CD34、CD105和CD90進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs中，CD29、CD90和CD105陽性表達(dá)，表達(dá)率分別為86.1%、93.7%和81.9%，CD31、CD45和CD34陰性表達(dá)，表達(dá)率為6.4%、1.4%和1.1%（圖1-3）。圖1-3流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表面標(biāo)志物3.BMSCs膜片觀察和膜片細(xì)胞死活熒光染色BMSCs經(jīng)膜片誘導(dǎo)液誘導(dǎo)10d左右，可見6孔板底部出現(xiàn)一層半透明的膜狀結(jié)構(gòu)，邊緣卷曲（圖1-4A），使用細(xì)胞刮刀沿邊緣卷曲處小心刮起可完整獲得細(xì)胞膜片。膜片呈乳白色半透明膜狀，收縮明顯，邊緣卷曲形態(tài)不規(guī)則，所構(gòu)建的膜片具有一定的彈性（圖1-4B）。膜片誘導(dǎo)液誘導(dǎo)10d左右，可見BMSCs復(fù)層生長排列致密且成極性排列，富含細(xì)胞外基質(zhì)（圖1-4C）。細(xì)胞死活熒光染色結(jié)果顯示膜片中紅染的死亡細(xì)胞較少，主要由大量綠染的具有活力的細(xì)胞構(gòu)成（圖1-4D）。

18圖1-4BMSCs膜片觀察和膜片細(xì)胞死活熒光染色A：BMSCs膜片邊緣卷曲；B：BMSCs膜片刮起后形態(tài)；C：BMSCs膜片顯微鏡下觀；D：BMSCs膜片細(xì)胞死活熒光染色；標(biāo)尺：200μm。5.BMSCs膜片的組織學(xué)觀察BMSCs膜片HE染色顯示膜片由3-4層細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成，厚約30-40μm左右，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞外基質(zhì)呈紅色，細(xì)胞重疊排列界限不清（圖1-5A、C）。Masson染色可見細(xì)胞通過膠原纖維緊密連接，富含胞外基質(zhì)（圖1-5B、D）。圖1-5BMSCs膜片的組織學(xué)觀察A：BMSCs膜片HE染色（標(biāo)尺：60μm）；B：BMSCs膜片Masson染色（標(biāo)尺：60μm）；C：BMSCs膜片HE染色（標(biāo)尺：20μm）；D：BMSCs膜片Masson染色（標(biāo)尺：20μm）.

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)及CEMP1基因轉(zhuǎn)染研究[D]. 吳玉銘.福建醫(yī)科大學(xué) 2018
[2]免疫磁珠分離人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 李靜.東南大學(xué) 2006
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本文編號：3478277