目的探索mazG基因參與調(diào)控mazEF毒素-抗毒素系統(tǒng)（TAs）介導(dǎo)的細(xì)菌生長(zhǎng)抑制與程序性死亡的分子機(jī)制,明確MazG蛋白真正的生理功能。方法以大腸桿菌MC4100為原型,通過(guò)relA基因的回復(fù)突變,獲得relA野生型的菌株MC4200。通過(guò)同源重組的方法,構(gòu)建大腸桿菌mazG、mazEF、mazEFG基因敲除菌株,測(cè)試mazG基因在不同基因背景菌株中過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)菌存活率的影響;通過(guò)rifampicin、H₂O₂及serine hydroxamate（SHT）等脅迫條件處理細(xì)菌,研究mazG及mazEFG操縱子缺失菌株的生長(zhǎng)曲線與存活率;克隆大腸桿菌mazG基因,構(gòu)建誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mazG及突變體pET28a-mazG E38A,在BL21菌株中表達(dá)純化MazG蛋白,通過(guò)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MazG蛋白的去磷酸酶活性;測(cè)試突變體過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)菌存活率的影響。結(jié)果 mazG過(guò)表達(dá)對(duì)大腸桿菌MC4200的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響,但對(duì)mazEFG基因敲除株具有顯著抑制作用;MazG的細(xì)胞毒性依賴于其N(xiāo)TP-PPase酶活性;mazEF的存在會(huì)顯著抑制m... 

【文章來(lái)源】：國(guó)際藥學(xué)研究雜志. 2020,47(08)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

不同物種來(lái)源MazG蛋白的序列比對(duì)注：VWQ04633.1：大腸桿菌；CNG39363.1：結(jié)核分枝桿菌；ACN47095.1：沙門(mén)氏菌；CYB76634.1：金黃色葡萄球菌

為探究基因maz EFG操縱子對(duì)細(xì)菌正常生長(zhǎng)造成的影響，本文對(duì)大腸桿菌MC4100菌株進(jìn)行了rel A基因的回復(fù)突變，構(gòu)建了MC4200菌株，使其獲得正常的嚴(yán)緊反應(yīng)能力。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了MC4200的maz EF、maz G、maz EFG基因敲除菌株，分別標(biāo)識(shí)為4200、4200△EF、4200△G和4200△EFG。文獻(xiàn)表明[10],maz G基因在大腸桿菌maz EFG敲除菌株中過(guò)表達(dá)會(huì)顯著抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。為進(jìn)一步探究maz G的細(xì)胞毒性與maz EF的關(guān)系及其對(duì)細(xì)菌生存率的影響，我們分別向MC4200和MC4200△EFG菌株轉(zhuǎn)入構(gòu)建好的p BAD33-maz G載體，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株分別命名為4200G和4200G△EFG。通過(guò)添加阿拉伯糖誘導(dǎo)Maz G蛋白的表達(dá)，觀察其對(duì)菌株生存率的影響。結(jié)果顯示4200G△EFG菌株過(guò)表達(dá)maz G時(shí)，其生長(zhǎng)速度（G=1.757±0.001495,n=3）明顯低于未添加Arab的4200G△EFG菌株（P<0.01），該結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果[10]吻合（圖1）。但引人注意的是，在4200G菌株過(guò)表達(dá)maz G時(shí)，生長(zhǎng)速度（G=1.246±0.001633,n=3）則與未添加Arab時(shí)4200G菌株無(wú)明顯差異（圖1）。這說(shuō)明maz G基因過(guò)表達(dá)時(shí)，顯著抑制了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，且這種細(xì)胞毒性與maz EF密切相關(guān)。這一結(jié)果表明，maz EFG操縱子作為一個(gè)整體共同發(fā)揮作用，它們?cè)谡{(diào)控細(xì)菌生長(zhǎng)抑制與凋亡中具有協(xié)同效應(yīng)，maz EF基因?qū)az G可能具有負(fù)調(diào)控作用。2.2 Maz G的細(xì)胞毒性依賴于其d NTP焦磷酸水解酶活性

圖2 不同物種來(lái)源MazG蛋白的序列比對(duì)注：VWQ04633.1：大腸桿菌；CNG39363.1：結(jié)核分枝桿菌；ACN47095.1：沙門(mén)氏菌；CYB76634.1：金黃色葡萄球菌為排除極化效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，在MC4200、MC4200△maz G及MC4200△EFG菌株中轉(zhuǎn)入p BAD-maz G質(zhì)粒，對(duì)應(yīng)菌株標(biāo)記為MC4200G、MC4200G△maz G及MC4200G△maz EFG。通過(guò)加入Ara誘導(dǎo)maz G基因的表達(dá)以回補(bǔ)Maz G，比較回補(bǔ)菌株與野生型菌株在10μg/ml利福平刺激下的存活率。Western印跡法結(jié)果表明（圖8），阿拉伯糖的加入成功誘導(dǎo)了Maz G的表達(dá)（攜帶6*His標(biāo)簽，圖8B）。maz G基因回補(bǔ)后，MC4200菌株和MC4200△G菌株與野生型菌株無(wú)顯著差異，這說(shuō)明maz G的敲除并未影響其上游maz EF的表達(dá)，未產(chǎn)生“極化效應(yīng)”。而MC4200△EFG在Maz G回補(bǔ)后，細(xì)菌存活率會(huì)顯著低于野生型菌株（P<0.01），這是由于maz G的活性所致，該結(jié)果與本文圖1結(jié)果及文獻(xiàn)[11]結(jié)果吻合。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]毒素-抗毒素系統(tǒng)及其典型模型研究進(jìn)展[J]. 熊建偉,杜現(xiàn)禮,車(chē)永勝,陳依軍.  藥物生物技術(shù). 2017(05)



本文編號(hào)：3471107