銅是植物生長發(fā)育必需的微量元素,在植物生理活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。植物在長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生了一套完整的銅穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),銅伴侶蛋白是重要的參與者。銅伴侶蛋白能夠結(jié)合銅離子并將其轉(zhuǎn)運至靶蛋白。擬南芥CCH（copper chaperone）是第一個被鑒定的植物銅伴侶蛋白。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,構(gòu)建了小黑楊PnCCH6、PnCCH7、PnCCH15和PnCCH17基因瞬時表達(dá)載體和兩類植物表達(dá)載體。通過瞬時轉(zhuǎn)化毛果楊原生質(zhì)體研究了 PnCCH6、PnCCH7、PnCCH15和PnCCH17蛋白的亞細(xì)胞定位。利用構(gòu)建的PnCCH7和PnCCH17基因的植物表達(dá)載體,通過蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型、cch和atx1突變體,獲得了 T3代轉(zhuǎn)基因植株并進(jìn)行了生理指標(biāo)測定。通過葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化小黑楊,獲得了轉(zhuǎn)PnCCH7和PnCCH17基因的抗性植株。主要研究結(jié)果如下:（1）利用已克隆的PnCCH6、PnCCH7、PnCCH15和PnCCH17基因,通過酶切連接法構(gòu)建了瞬時表達(dá)載體pBS-PnCCHs-GFP,并轉(zhuǎn)化毛果楊莖原生質(zhì)體。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明,PnCCH6、PnCCH7蛋白定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－］小黒楊尸《ＣＣ７／ｓ基因的ＰＣＲ純化產(chǎn)物??Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ＰｎＣＣＨ６；?２：?ＰｎＣＣＨ７－，?３：?ＰｎＣＣＨｌＳ；?４：?ＰｎＣＣＨ１７〇??

?２小黑楊ＰｎＣＣＨｓ蛋白的亞細(xì)胞定位???Ｍ?１２?Ｍ?１?２??■?ｂｐ?—？?■＇?＾??Ｍ?１２?Ｍ?１?２??５００?ｂｐ?—？?．１：??圖２－２小黑楊Ｐ〃ＣＣ／＊基因ＰＣＲ純化產(chǎn)物酶切結(jié)果??Ａ：?ＰｎＣＣＨ６＇?Ｂ：?ＰｎＣＣＨ７．，?Ｃ：?ＰｎＣＣＨ１５；?�。荆�?ＰｎＣＣＨ１７〇??Ｍ：?ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；?］?？？目的基因；２：目的基因酶切產(chǎn)物。??５０００?ｂｐ?—？ｌ＾；ｐ？ｒ＾ｋ?．?ＩｌＭｉｌｌｌｌ，＾?１??■??圖２－３瞬時表達(dá)載體ｐＢＳ－ＧＦＰ質(zhì)粒雙酶切結(jié)果??Ｍ：?ＤＬ５０００Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｐＢＳ－ＧＦＰ?質(zhì)粒：２：?ｐＢＳ－ＧＦＰ?質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。??利用Ｔ４連接酶連接目的基因ＰＣＲ產(chǎn)物及ｐＢＳ－ＧＦＰ瞬時表達(dá)載體的酶切產(chǎn)物。連接??產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化Ｔｒａｗｌ－Ｔｌ大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆，在含有氨芐青霉素的ＬＢ??液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。使用表２－１的引物對重組質(zhì)粒的目的基因進(jìn)行??ＰＣＲ鑒定。將鑒定后條帶正確的重組質(zhì)粒的相應(yīng)菌種送公司測序。測序結(jié)果表明，重組??載體中插入的基因序列正確，并且可以與ＧＦＰ蛋白融合表達(dá)，由此證明重組表達(dá)載體??構(gòu)建成功。??－１１－??

ｓ蛋白的功能，本研究首先使用ＰｒｏｔＣｏｍｐ?９．０??（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｍｏｃｌ．ｓｏｆｔｂｅｎｙ．ｃｏｍ）軟件在線預(yù)測了小黑楊?ＰｎＣＣＨ６、ＰｎＣＣＨ７、ＰｎＣＣＨ１５、??ＰｎＣＣＨ１７蛋白的亞細(xì)胞定位。預(yù)測結(jié)果顯示，小黑楊４個ＰｎＣＣＨｓ蛋白均定位于細(xì)胞??核和細(xì)胞膜。此外，本研宄構(gòu)建了小黑楊八７ＣＣ／／（５、乃７ＣＣ／／７、及Ｐ／７ＣＣ７／７７??基因的亞細(xì)胞定位瞬時表達(dá)載體，利用構(gòu)建的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)化毛果楊原生??質(zhì)體，同時使用ｐＢＳ－ＧＦＰ空載體作為對照。亞細(xì)胞定位結(jié)果如圖２－４所示，Ｌｉｇｈｔ為明??場中觀察到的原生質(zhì)體，ＧＦＰ為激光處于４８０?ｎｎｉ時綠色熒光蛋白ＧＦＰ及ＧＦＰ融合蛋??白的觀察結(jié)果，Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ為激光處于５２０?ｎｍ時葉綠素自發(fā)紅色熒光的觀察結(jié)果，??Ｍｅｒｇｅ為三者的疊加結(jié)果。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，在整個細(xì)胞中均可觀察到綠色熒光蛋??白ＧＦＰ?（對照）、ＰｎＣＣＨ６－ＧＦＰ、ＰｎＣＣＨ７－ＧＦＰ蛋白的綠色熒光，表明ＰｎＣＣＨ６、??ＰｎＣＣＨ７蛋白與ＧＦＰ蛋白定位相同，均定位于細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。瞬時轉(zhuǎn)化??乃７ＣＣ／／／５和７基因的毛果楊原生質(zhì)體能夠在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上觀察到綠色熒??光，表明ＰｎＣＣＨ１５、ＰｎＣＣＨ１７蛋白定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞核。??Ｌｉｇｈｔ?ＧＦＰ?Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ?Ｍｅｒｇｅ??－動塞＿幽??＿＿＿＿＿??ＨＨＨ?ＩＩＨ１Ｈ??圖２－４小黑楊ＰｎＣＣＨｓ蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果??Ａ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、Ｑ：明場中原生質(zhì)體圖像；Ｂ、Ｆ、Ｊ、Ｎ、Ｒ：綠色熒光蛋白信號。??Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｏ、Ｓ：葉綠素自發(fā)熒光圖像；Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｔ：?ＧＦＰ和Ｃｈｌｏｒｏ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3469934