圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）是一種典型的產(chǎn)油酵母,能在多種營(yíng)養(yǎng)元素限制下產(chǎn)油脂,另外還可合成類胡蘿卜素。但是作為非模式酵母,圓紅冬孢酵母的遺傳操作平臺(tái)還很不成熟。本研究主要在R.toruloides NP11（簡(jiǎn)稱Rt NP11）中建立CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),為遺傳改造提供技術(shù)手段。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將內(nèi)源二酯酰甘油�；D(zhuǎn)移酶基因DGAT2（Diacylglycerol acyltransferase）轉(zhuǎn)入Rt NP11菌株中,得到過表達(dá)DGAT2的菌株Rt NP11-DGAT2,比較評(píng)價(jià)細(xì)胞油脂含量的變化。在此轉(zhuǎn)化方法基礎(chǔ)上,從Rt NP11基因組中克隆RNA聚合酶III啟動(dòng)子U6,從Rt NP11基因組中鑒定tRNA^Gly基因,U6與tRNA^Gly基因融合形成人工雜合啟動(dòng)子U6-tRNAGly。合成密碼子優(yōu)化的Cas9基因,Cas9表達(dá)元件與gRNA轉(zhuǎn)錄元件通過Gibson方法連接到質(zhì)�？蚣�,以類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵基因—八氫番茄紅素脫氫酶基因CRT1為CRISPR編輯的驗(yàn)證靶點(diǎn),2... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 圓紅冬孢酵母概述
        1.1.1 圓紅冬孢酵母的分類地位和生理特征
        1.1.2 圓紅冬孢酵母應(yīng)用研究進(jìn)展
    1.2 微生物油脂概述
        1.2.1 微生物油脂的概念和特點(diǎn)
        1.2.2 二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)在油脂合成中的作用
        1.2.3 DGAT在油脂合成中的應(yīng)用
    1.3 圓紅冬孢酵母遺傳工程研究進(jìn)展
        1.3.1 圓紅冬孢酵母遺傳轉(zhuǎn)化方法
        1.3.2 圓紅冬孢酵母遺傳表達(dá)系統(tǒng)研究概況
    1.4 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在遺傳操作中的應(yīng)用
        1.4.1 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)概述
        1.4.2 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用
    1.5 本文研究思路
第二章 圓紅冬孢酵母遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 引物
        2.2.3 試劑
        2.2.4 儀器和設(shè)備
        2.2.5 培養(yǎng)基
        2.2.6 RNA提取
        2.2.7 RNA反轉(zhuǎn)錄
        2.2.8 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
        2.2.9 PCR產(chǎn)物純化
        2.2.10 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.11 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.12 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.13 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證
        2.2.14 E.coli菌種的保藏與測(cè)序
        2.2.15 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1 感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.16 農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定
        2.2.17 農(nóng)桿菌菌種的保藏
        2.2.18 農(nóng)桿菌與酵母共培養(yǎng)
        2.2.19 圓紅冬孢酵母基因組提取
        2.2.20 酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定和保藏
        2.2.21 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        2.2.22 油脂的提取
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果分析
        2.3.2 農(nóng)桿菌PCR驗(yàn)證結(jié)果分析
        2.3.3 酵母轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果分析
        2.3.4 過表達(dá)DGAT2 基因?qū)t NP11 油脂合成的影響
    2.4 本章小結(jié)
第三章 圓紅冬孢酵母CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 引物
        3.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
        3.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.5 免疫印跡(Western Blot)
        3.2.6 酵母轉(zhuǎn)化子的測(cè)序
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果分析
        3.3.2 農(nóng)桿菌PCR驗(yàn)證結(jié)果分析
        3.3.3 酵母轉(zhuǎn)化子Cas9 蛋白表達(dá)檢測(cè)
        3.3.4 酵母轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果分析
        3.3.5 酵母轉(zhuǎn)化子測(cè)序結(jié)果
    3.4 本章小結(jié)
第四章 gRNA啟動(dòng)子對(duì)圓紅冬孢酵母基因編輯效率的影響
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株和質(zhì)粒
        4.2.2 引物
        4.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
        4.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.5 酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定和測(cè)序
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果分析
        4.3.2 農(nóng)桿菌PCR驗(yàn)證結(jié)果分析
        4.3.3 酵母轉(zhuǎn)化子表型鑒定
        4.3.4 酵母轉(zhuǎn)化子測(cè)序結(jié)果
        4.3.5 四種gRNA啟動(dòng)子的基因編輯效率比較
        4.3.6 溫度對(duì)基因編輯效率的影響
    4.4 本章小結(jié)
第五章 切割位點(diǎn)對(duì)圓紅冬孢酵母基因編輯效率的影響
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 菌株和質(zhì)粒
        5.2.2 引物
        5.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
        5.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.5 酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定與測(cè)序
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果分析
        5.3.2 酵母轉(zhuǎn)化子表型鑒定
    5.4 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論和展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]高產(chǎn)類胡蘿卜素的紅酵母突變菌株篩選及其性能研究[D]. 高寧.大連工業(yè)大學(xué) 2017
[2]產(chǎn)油酵母圓紅冬孢酵母二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶的鑒定和性質(zhì)研究[D]. 王珍.江南大學(xué) 2016
[3]圓紅冬孢酵母類胡蘿卜素生產(chǎn)途徑的誘變改造及代謝分析[D]. 劉妍.大連工業(yè)大學(xué) 2016
[4]圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）21167菌株產(chǎn)油脂的研究[D]. 王琦.中國(guó)海洋大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3467698