圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）是一種典型的產(chǎn)油酵母,能在多種營養(yǎng)元素限制下產(chǎn)油脂,另外還可合成類胡蘿卜素。但是作為非模式酵母,圓紅冬孢酵母的遺傳操作平臺還很不成熟。本研究主要在R.toruloides NP11（簡稱Rt NP11）中建立CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),為遺傳改造提供技術手段。通過農(nóng)桿菌介導轉化法將內源二酯酰甘油�；D移酶基因DGAT2（Diacylglycerol acyltransferase）轉入Rt NP11菌株中,得到過表達DGAT2的菌株Rt NP11-DGAT2,比較評價細胞油脂含量的變化。在此轉化方法基礎上,從Rt NP11基因組中克隆RNA聚合酶III啟動子U6,從Rt NP11基因組中鑒定tRNA^Gly基因,U6與tRNA^Gly基因融合形成人工雜合啟動子U6-tRNAGly。合成密碼子優(yōu)化的Cas9基因,Cas9表達元件與gRNA轉錄元件通過Gibson方法連接到質粒框架,以類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵基因—八氫番茄紅素脫氫酶基因CRT1為CRISPR編輯的驗證靶點,2... 

【文章來源】：青島大學山東省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 圓紅冬孢酵母概述
        1.1.1 圓紅冬孢酵母的分類地位和生理特征
        1.1.2 圓紅冬孢酵母應用研究進展
    1.2 微生物油脂概述
        1.2.1 微生物油脂的概念和特點
        1.2.2 二酰甘油�；D移酶(DGAT)在油脂合成中的作用
        1.2.3 DGAT在油脂合成中的應用
    1.3 圓紅冬孢酵母遺傳工程研究進展
        1.3.1 圓紅冬孢酵母遺傳轉化方法
        1.3.2 圓紅冬孢酵母遺傳表達系統(tǒng)研究概況
    1.4 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在遺傳操作中的應用
        1.4.1 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)概述
        1.4.2 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的應用
    1.5 本文研究思路
第二章 圓紅冬孢酵母遺傳轉化方法的建立
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 菌株和質粒
        2.2.2 引物
        2.2.3 試劑
        2.2.4 儀器和設備
        2.2.5 培養(yǎng)基
        2.2.6 RNA提取
        2.2.7 RNA反轉錄
        2.2.8 聚合酶鏈式反應(PCR)
        2.2.9 PCR產(chǎn)物純化
        2.2.10 重組質粒的構建
        2.2.11 重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞
        2.2.12 重組質粒的提取
        2.2.13 重組質粒酶切驗證
        2.2.14 E.coli菌種的保藏與測序
        2.2.15 重組質粒轉化農(nóng)桿菌AGL1 感受態(tài)細胞
        2.2.16 農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定
        2.2.17 農(nóng)桿菌菌種的保藏
        2.2.18 農(nóng)桿菌與酵母共培養(yǎng)
        2.2.19 圓紅冬孢酵母基因組提取
        2.2.20 酵母轉化子的鑒定和保藏
        2.2.21 生長曲線的測定
        2.2.22 油脂的提取
    2.3 結果與討論
        2.3.1 質粒酶切驗證結果分析
        2.3.2 農(nóng)桿菌PCR驗證結果分析
        2.3.3 酵母轉化子鑒定結果分析
        2.3.4 過表達DGAT2 基因對Rt NP11 油脂合成的影響
    2.4 本章小結
第三章 圓紅冬孢酵母CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的構建
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株和質粒
        3.2.2 引物
        3.2.3 聚合酶鏈式反應(PCR)
        3.2.4 重組質粒的構建
        3.2.5 免疫印跡(Western Blot)
        3.2.6 酵母轉化子的測序
    3.3 結果與討論
        3.3.1 質粒酶切驗證結果分析
        3.3.2 農(nóng)桿菌PCR驗證結果分析
        3.3.3 酵母轉化子Cas9 蛋白表達檢測
        3.3.4 酵母轉化子鑒定結果分析
        3.3.5 酵母轉化子測序結果
    3.4 本章小結
第四章 gRNA啟動子對圓紅冬孢酵母基因編輯效率的影響
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株和質粒
        4.2.2 引物
        4.2.3 聚合酶鏈式反應(PCR)
        4.2.4 重組質粒的構建
        4.2.5 酵母轉化子的鑒定和測序
    4.3 結果與討論
        4.3.1 質粒酶切驗證結果分析
        4.3.2 農(nóng)桿菌PCR驗證結果分析
        4.3.3 酵母轉化子表型鑒定
        4.3.4 酵母轉化子測序結果
        4.3.5 四種gRNA啟動子的基因編輯效率比較
        4.3.6 溫度對基因編輯效率的影響
    4.4 本章小結
第五章 切割位點對圓紅冬孢酵母基因編輯效率的影響
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 菌株和質粒
        5.2.2 引物
        5.2.3 聚合酶鏈式反應(PCR)
        5.2.4 重組質粒的構建
        5.2.5 酵母轉化子的鑒定與測序
    5.3 結果與分析
        5.3.1 質粒酶切驗證結果分析
        5.3.2 酵母轉化子表型鑒定
    5.4 本章小結
第六章 結論和展望
    6.1 結論
    6.2 展望
參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]CRISPR/Cas9介導柑橘CsLOB1基因啟動子的多位點編輯[J]. 鄒修平,范迪,彭愛紅,何永睿,許蘭珍,雷天剛,姚利曉,李強,羅克明,陳善春.  園藝學報. 2019(02)
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博士論文
[1]基于農(nóng)桿菌介導的圓紅冬孢酵母遺傳重組系統(tǒng)的研究[D]. 孫文怡.大連理工大學 2017

碩士論文
[1]高產(chǎn)類胡蘿卜素的紅酵母突變菌株篩選及其性能研究[D]. 高寧.大連工業(yè)大學 2017
[2]產(chǎn)油酵母圓紅冬孢酵母二酰甘油�；D移酶的鑒定和性質研究[D]. 王珍.江南大學 2016
[3]圓紅冬孢酵母類胡蘿卜素生產(chǎn)途徑的誘變改造及代謝分析[D]. 劉妍.大連工業(yè)大學 2016
[4]圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）21167菌株產(chǎn)油脂的研究[D]. 王琦.中國海洋大學 2012



本文編號：3467698