發(fā)布時間：2021-10-22 16:04

　　苗期低溫會影響普通煙草（Nicotiana tabacum）正常生長發(fā)育,導致生長勢弱,葉數(shù)減少,葉片窄小,煙葉產量和質量降低。前期研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫條件下茉莉酸信號途徑和合成途徑中關鍵基因表達量上升。NINJA蛋白是茉莉酸信號途徑中聯(lián)系JAZ蛋白與下游轉錄因子的重要因子,煙草NtNINJA基因和NtJAZ1基因的功能關系并不明晰。CRISPR/Cas9基因編輯技術可運用于基因功能驗證。本實驗運用CRISPR/Cas9基因編輯技術對普通煙草NtNINJA進行基因編輯,利用熒光定量PCR技術,測定T₀代突變株和野生型植株在低溫脅迫和常溫條件下NtJAZ1的表達量,了解在NtNINJA基因突變下,NtJAZ1基因表達量差異,為下一步解析NtNINJA突變對NtJAZ1的表達的影響奠定基礎。主要結果如下:1.使用靶位點1（F:5-GTTGCAATCCTTAAGGCGTT,R:5-AACGGGTTAA GGATTGCAAC）和靶位點2（F:5-AAAGAACACGTCCTATTAAG,R:5-CTTAA TAGGACGTGTTCTTT）序列作為靶位點能夠編輯普通煙草品種紅... 

【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 基因編輯技術
        1.1.1 基因編輯技術簡介
        1.1.2 基因編輯技術發(fā)展歷程
    1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)
        1.2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史
        1.2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結構
        1.2.3 CRISPR/Cas的分類
        1.2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理
        1.2.5 CRISPR/Cas9基因編輯技術在重要作物中的應用
        1.2.6 CRISPR/Cas9基因編輯技術最新研究進展
    1.3 茉莉酸信號轉導途徑
        1.3.1 茉莉酸的生物合成
        1.3.2 茉莉酸信號轉導途徑
        1.3.3 NtNINJA基因和JAZ蛋白家族
    1.4 茉莉酸信號轉導途徑參與應答低溫脅迫
        1.4.1 應答低溫脅迫的基因
        1.4.2 茉莉酸提高植物寒冷防御能力
第2章 引言
    2.1 研究的目的與意義
    2.2 研究內容
    2.3 技術路線
第3章 CRISPR/Cas9編輯煙草NtNINJA基因
    3.1 材料與方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株與載體
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基配方
        3.1.5 大腸桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基配方
        3.1.6 農桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基配方
        3.1.7 主要試劑溶液
        3.1.8 引物
    3.2 表達載體構建
        3.2.1 pCACas9骨架載體的獲得
        3.2.2 sgRNA質粒的獲得
        3.2.3 靶位點設計、選擇
        3.2.4 靶位點的sgRNA組裝
        3.2.5 sgRNA插入pCACas9骨架載體
        3.2.6 表達載體轉化農桿菌
    3.3 煙草的遺傳轉化
        3.3.1 煙草無菌苗的獲得
    3.4 突變體篩選及檢測
        3.4.1 CTAB法提取煙草基因組DNA
        3.4.2 突變體篩選
        3.4.3 突變類型的測定
    3.5 結果與分析
        3.5.1 pCACas9-NtNINJA-AB表達載體的構建
        3.5.2 煙草遺傳轉化
        3.5.3 CRISPR/Cas9編輯煙草NtNINJA基因的T0代轉基因植株NtNINJA基因突變情況分析
    3.6 本章小結
第4章 NtNINJA基因堿基缺失煙草植株的克隆與序列分析
    4.1 材料
    4.2 方法
        4.2.1 突變型NtNINJA引物設計
        4.2.2 總RNA的提取
        4.2.3 逆轉錄成cDNA
        4.2.4 PCR擴增
        4.2.5 目的基因膠回收
        4.2.6 連接與轉化
        4.2.7 重組質粒的檢測與測序
        4.2.8 生物信息學分析
    4.3 結果分析
        4.3.1 煙草總RNA的提取檢測
        4.3.2 突變型NtNINJA的PCR擴增與膠回收
        4.3.3 突變型NtNINJA的菌液PCR檢測
        4.3.4 突變NtNINJA序列生物信息學分析
    4.4 本章小結
第5章 低溫條件下NtNINJA基因突變型煙草茉莉酸途徑關鍵基因NtJAZ1的定量表達分析
    5.1 材料
    5.2 方法
        5.2.1 材料處理
        5.2.2 取樣
        5.2.3 總RNA的提取
        5.2.4 逆轉錄成cDNA
        5.2.5 引物設計
        5.2.6 定量PCR擴增
    5.3 結果分析
        5.3.1 提取RNA的檢測
        5.3.2 NtJAZ1在不同處理中的表達量分析
    5.4 本章小結
第6章 結論與討論
    6.1 結論
        6.1.1 SgRNA/Cas9編輯紅大NtNINJA基因
        6.1.2 突變NtNINJA基因的克隆及生物信息學分析
        6.1.3 低溫脅迫NtNINJA基因突變型煙草NtJAZ1的定量表達分析
    6.2 討論
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[7]基于CRISPR/Cas9技術的水稻千粒重基因tgw6突變體的創(chuàng)建[J]. 王加峰,鄭才敏,劉維,羅文龍,王慧,陳志強,郭濤.  作物學報. 2016(08)
[8]玉米耐鹽基因ZmHKT1的序列變異分析[J]. 姜志磊,姜昱,劉艷芝,蔣超,金峰學,李毅丹.  玉米科學. 2015(05)
[9]應用CRISPR/Cas9技術在楊樹中高效敲除多個靶基因[J]. 劉婷婷,范迪,冉玲玉,姜淵忠,劉瑞,羅克明.  遺傳. 2015(10)
[10]Genome-wide association analyses provide genetic and biochemical insights into natural variation in rice metabolism[J].   Science Foundation in China. 2014(02)

博士論文
[1]利用TALENs和CRISPR/Cas9基因編輯技術改良水稻稻瘟病抗性[D]. 王福軍.廣西大學 2016



本文編號：3451431