背景:環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）及其轉(zhuǎn)錄共激活因子1（CREB-regulated transcription coactivator 1,CRTC1）廣泛表達(dá)于大腦,兩者作為轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)神經(jīng)元活動(dòng)激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄依賴的突觸可塑性的維持過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),長時(shí)程（LTP）增強(qiáng)能誘導(dǎo)CRTC1入核,與CREB一同介導(dǎo)即早基因如c-fos,Arc,BDNF的轉(zhuǎn)錄,維持長時(shí)程增強(qiáng)。另外CREB在維持LTD中具也有重要作用,而CRTC1在LTD中的作用尚不清楚。CRTC2是CRTC1的直系同源基因,在小鼠肝臟細(xì)胞中可以介導(dǎo)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,生物信息學(xué)分析提示兩者的功能可能具有保守性,所以CRTC1在神經(jīng)元中可能介導(dǎo)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在神經(jīng)元發(fā)生LTD過程中,突觸蛋白和AMPA受體的降解對神經(jīng)元維持LTD具有重要作用。因此,我們想探究CRTC1在cLTD的刺激條件下是否入核,以及是否介導(dǎo)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以降解AMPA受體。目的:檢測CRTC1在cLTD的刺激下是否入核調(diào)控自噬... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

cLTD促進(jìn)神經(jīng)元自噬水平上升誘導(dǎo)原代培養(yǎng)天的神經(jīng)元產(chǎn)生，小時(shí)后收樣，用蛋白質(zhì)免疫印跡法

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果20自噬是自噬囊泡包裹待降解物送至溶酶體降解的過程，即自噬流[24]。溶酶體內(nèi)部是一個(gè)酸性的環(huán)境，GFP的熒光在酸性環(huán)境中容易淬滅，而mCherry的熒光在酸性環(huán)境中則不易淬滅[25]。為了進(jìn)一步直觀地檢測神經(jīng)元發(fā)生cLTD時(shí)自噬囊泡的變化情況，我們構(gòu)建mCherry-GFP-LC3的過表達(dá)質(zhì)粒，通過慢病毒包裝感染的方式在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中過表達(dá)mCherry-GFP-LC3，LC3可以結(jié)合自噬底物將其附著在自噬囊泡上，所以自噬體中同時(shí)存在mCherry和GFP，其囊泡呈現(xiàn)黃色；溶酶體中GFP被淬滅，只保留mCherry，呈現(xiàn)紅色。我們將能過表達(dá)mCherry-GFP-LC3的病毒感染原代培養(yǎng)10天左右的神經(jīng)元，4天后誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生cLTD，2小時(shí)后固定封片，通過共聚焦顯微鏡拍攝神經(jīng)元中的熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1.3所示，cLTD可引起神經(jīng)元樹突和胞體中的GFP和mCherry的點(diǎn)數(shù)顯著增加，這表明cLTD可誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生更多的自噬囊泡，自噬囊泡更多地與溶酶體結(jié)合。圖1.3cLTD可誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生自噬囊泡

cLTD可以誘導(dǎo)CRTC1與CREB形成復(fù)合體


本文編號：3449676