背景目前,全世界治療性重組蛋白（包括重組抗體）的生產(chǎn)近70%是用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的。影響重組蛋白在CHO細(xì)胞中高效且穩(wěn)定表達(dá)的因素很多,其中表達(dá)載體是其中最重要的因素之一。由于目的基因轉(zhuǎn)入后的隨機(jī)整合,以及基因沉默和不穩(wěn)定表達(dá)的經(jīng)常發(fā)生,限制了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。因此高效穩(wěn)定表達(dá)載體的構(gòu)建已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目的探究不同內(nèi)含子元件和polyA元件對(duì)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平及穩(wěn)定性的的影響及其機(jī)制。方法1.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)含子序列hCMV intron A（hCMVI）、TPL intron（TPLI）、SV40 intron（SVI）、CHEF1 gene intron1（CHEFI）,PCR擴(kuò)增或人工合成內(nèi)含子片段替換原表達(dá)載體pIRES-EGFP中內(nèi)含子IVS,構(gòu)建含不同內(nèi)含子的表達(dá)載體。2.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的polyA序列（BGH polyA、Mutation BGH polyA、Synthetic polyA、HSV TK polyA、SV40 late polyadenylation signal）,... 

【文章來(lái)源】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

不同內(nèi)含子表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

圖 1-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染效率與載體大小關(guān)系。接著觀察不同內(nèi)含子元件對(duì)瞬時(shí)基因表達(dá)的影響，流式檢測(cè) eGFP 的發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)最高的是轉(zhuǎn)染 SVI（MFI=5.2×104）的載體，其次為 IVSIVI 和 CHEFI（4.3×104、3.6×104、2.8×104、1.5×104）的載體。且轉(zhuǎn)染 和 TPLI 的載體細(xì)胞中 eGFP 瞬時(shí)表達(dá)明顯高于 hCMVI 和 CHEFI(P<3)。

圖 1-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染效率與載體大小關(guān)系。接著觀察不同內(nèi)含子元件對(duì)瞬時(shí)基因表達(dá)的影響，流式檢測(cè) eGFP 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)最高的是轉(zhuǎn)染 SVI（MFI=5.2×104）的載體，其次為 IVSI、TPI、hCMVI 和 CHEFI（4.3×104、3.6×104、2.8×104、1.5×104）的載體。且轉(zhuǎn)染 SVI、IVSI 和 TPLI 的載體細(xì)胞中 eGFP 瞬時(shí)表達(dá)明顯高于 hCMVI 和 CHEFI(P<0.0 5；圖 1-3)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3442731