山楂葉螨（Amphitetranychus viennensis）是我國(guó)果樹重要葉面害蟲,由于長(zhǎng)期大量使用化學(xué)殺螨劑而產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性問(wèn)題。因此,急需尋找新的防治方法。RNA干擾（RNAi）技術(shù)作為新興的生物技術(shù),逐漸在害蟲防治領(lǐng)域得到應(yīng)用。但是要將這一技術(shù)應(yīng)用于山楂葉螨的防治,首先要獲得RNAi的靶標(biāo)基因并檢測(cè)干擾效率。本文對(duì)山楂葉螨進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共得到10 GB Clean Data,34,631條Unigene,其中20,398個(gè)得到功能注釋;數(shù)據(jù)質(zhì)量經(jīng)過(guò)單堿基質(zhì)量、Base content分布、GC content分布和Sequence base quality四個(gè)指標(biāo)評(píng)定,表明測(cè)序結(jié)果良好。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的深入分析,獲得高通量的潛在靶標(biāo)基因。在山楂葉螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索后獲得山楂葉螨ATPase A基因序列。利用PCR擴(kuò)增獲得編碼山楂葉螨V-ATPase A的基因片段。以這一持家基因?yàn)榘袠?biāo),驗(yàn)證山楂葉螨RNAi方法的可行性。本研究共嘗試了3種山楂葉螨RNAi方法:葉柄吸收法、葉片吸收法和烘干葉片吸收法。結(jié)果表明烘干葉片吸收法效果最佳。隨后我們?cè)谏介~螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲... 

【文章來(lái)源】：山西大學(xué)山西省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖2.1分析流程

第三章山楂葉螨RNAi方法建立25圖3.1三種喂食山楂葉螨dsRNA的方法Fig.3.1ThreemethodsoffeedingdsRNAforA.viennensis注：A：方法一Method1;B：方法二Method2;C：方法三Method33.3.2沉默效率檢測(cè)每個(gè)處理組取20頭山楂葉螨提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，方法同3.1.2。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)量的變化，反應(yīng)體系如下：表3.8RT-qPCR反應(yīng)體系Tab.3.8RT-qPCRreactionsystem2×SYBRGreen10μl10μM正向引物0.32μl10μM反向引物0.32μlcDNA模板1.6μlddH2O7.76μlTotal20μl以上體系所使用的引物見表3.5，以GAPDH為內(nèi)參基因，熒光定量PCR程序：95℃30s；95℃5s，60℃31s，循環(huán)數(shù)為40；95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。程序結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，采用2-△△CT法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)值差異顯著性分析。3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.4.1山楂葉螨AvATPaseA基因片段克隆在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得山楂葉螨AvATPase基因cDNA以后，找到其1866bp長(zhǎng)度的開放閱讀框。用Primer5.0軟件在開放閱讀框中設(shè)計(jì)用于合成dsRNA基因片段的引物和RT-qPCR引物。PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶（圖3.2），將所得片段與T載體連接，得到含有目的基因的克隆載體。

取食雙鏈RNA對(duì)山楂葉螨的基因干擾和沉默效率研究26圖3.2山楂葉螨AvATPaseA基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.3.2ThePCRamplificationofAvATPaseAgenefragmentfromA.viennensis注：M：DL5000DNAmarker；1：AvATPaseA的擴(kuò)增產(chǎn)物CloningofAvATPaseA3.4.2山楂葉螨不同喂食方法的沉默效率對(duì)山楂葉螨dsRNA處理后，收集不同處理組的山楂葉螨樣本，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，將cDNA稀釋20倍作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。RT-qPCR分析結(jié)果顯示，3種方法對(duì)AvATPaseA的沉默效率如圖所示（圖3.3）。


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