本文關(guān)鍵詞：奶山羊INSIG基因?qū)θ橄偕掀ぜ?xì)胞中脂代謝的影響研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胰島素誘導(dǎo)基因(Insulin-induced genes,INSIGs)是調(diào)控脂代謝的重要因子,為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白,包括INSIG1和INSIG2兩個(gè)亞型。其兩個(gè)亞型在不同組織中的生物學(xué)功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)理存在一定的差異,尚未見(jiàn)到有關(guān)INSIGs基因在山羊乳腺細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的功能研究。本研究以西農(nóng)薩能奶山羊乳腺組織為材料,利用實(shí)時(shí)熒光定量(q RT-PCR)檢測(cè)INSIGs不同亞型在不同泌乳時(shí)期的表達(dá)情況。構(gòu)建INSIG1和INSIG2基因的重組腺病毒超表達(dá)載體,包裝出高滴度的腺病毒,設(shè)計(jì)并合成特異性沉默INSIG1和INSIG2基因的si RNA,研究INSIGs基因超表達(dá)或干擾后對(duì)山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMEC)中脂代謝相關(guān)基因、甘油三酯(TAG)含量、總膽固醇(TC)含量及脂滴積累的影響,為該基因在奶山羊脂代謝中的功能研究提供理論依據(jù)。本研究獲得的結(jié)果如下:(1)在山羊整個(gè)泌乳周期中,乳腺中INSIG1和INSIG2基因的表達(dá)趨勢(shì)較為相似,均在泌乳前期表達(dá)量最高,干奶期表達(dá)量最低。(2)INSIGs兩個(gè)亞型均具有跨膜蛋白特性結(jié)構(gòu),均含有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),且兩者的保守區(qū)域集中在跨膜區(qū),該區(qū)域的核苷酸相似性為71%,氨基酸相似性為80%。(3)成功構(gòu)建奶山羊INSIG1基因重組腺病毒超表達(dá)載體,獲得具有較高滴度(2×108U/m L)的超表達(dá)腺病毒(Ad-INSIG1)。Ad-INSIG1感染山羊乳腺上皮細(xì)胞48 h后,INSIG1基因的m RNA表達(dá)量上調(diào)約500倍,SREBP1和SCAP的m RNA水平無(wú)顯著變化,但能夠顯著下調(diào)細(xì)胞中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá):脂肪酸從頭合成(ACCα、FASN)及去飽和(SCD1)、TAG合成(GPAM、DGAT2)及TAG分解(ATGL)。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)TAG含量無(wú)顯著變化,TC含量顯著下降,脂滴的積累減少。(4)成功構(gòu)建奶山羊INSIG2基因重組腺病毒超表達(dá)載體,獲得了具有較高滴度(3×108 U/m L)的超表達(dá)腺病毒(Ad-INSIG2)。Ad-INSIG2感染山羊GMEC48 h后,INSIG2基因的m RNA表達(dá)量上調(diào)約50倍,SREBP1和SCAP的m RNA水平無(wú)顯著變化,但能夠顯著下調(diào)細(xì)胞中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá):INSIG1、FA從頭合成(ACCα)、FA去飽和(SCD1)、TAG合成(AGPAT6、DGAT2)及TAG分解(HSL)。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)TAG含量、TC含量及脂滴的積累均顯著下降。(5)針對(duì)INSIG1和INSIG2基因分別各設(shè)計(jì)兩對(duì)si RNA序列(si INSIG1-100、si INSIG1-547、si INSIG2-175及si INSIG2-244),其中si INSIG1-547、si INSIG2-175轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞48 h后,INSIG1和INSIG2基因的表達(dá)量分別下降了80%左右。同時(shí)轉(zhuǎn)染這兩對(duì)si RNA時(shí),能有效沉默INSIG1和INSIG2的表達(dá)(-80%)。在山羊乳腺上皮細(xì)胞中,單獨(dú)干擾INSIG1或INSIG2時(shí),能在一定程度上上調(diào)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)、TAG含量及脂滴積累,TC含量顯著上調(diào);當(dāng)同時(shí)干擾INSIG1和INSIG2時(shí),能夠顯著刺激脂合成相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞中TAG和TC的積累,脂滴積累也明顯增加。本研究表明,INSIG1和INSIG2均能調(diào)控山羊乳腺上皮細(xì)胞中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá),超表達(dá)INSIGs能抑制細(xì)胞中脂質(zhì)積累,單獨(dú)干擾INSIG1或INSIG2時(shí),細(xì)胞中脂代謝無(wú)顯著變化,只有同時(shí)干擾INSIGs兩個(gè)亞型才能解除對(duì)脂質(zhì)積累的抑制作用。相較于INSIG1,INSIG2可能對(duì)TAG代謝的影響更大。
【關(guān)鍵詞】：INSIGs 山羊乳腺上皮細(xì)胞 超表達(dá) RNA干擾 脂代謝
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S827
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-24
• 1.1 INSIG基因的發(fā)現(xiàn)14-15
• 1.2 INSIGs的分子結(jié)構(gòu)15
• 1.3 INSIGs的功能15-18
• 1.3.1 INSIGs參與固醇介導(dǎo)的SREBPs蛋白調(diào)控16-18
• 1.3.2 INSIGs參與固醇介導(dǎo)的HMGR蛋白調(diào)控18
• 1.4 INSIGs的表達(dá)及調(diào)控18-20
• 1.5 INSIGs的研究進(jìn)展20-23
• 1.5.1 INSIG與PPAR對(duì)脂代謝的調(diào)控及代謝綜合征相關(guān)20-21
• 1.5.2 INSIGs與micro RNA對(duì)脂代謝的調(diào)控相關(guān)21
• 1.5.3 INSIGs多態(tài)性與肥胖相關(guān)21-22
• 1.5.4 INSIGs與癌癥相關(guān)22-23
• 1.6 本研究的目的及意義23-24
• 第二章 INSIGs兩個(gè)亞型在山羊乳腺的表達(dá)豐度及序列比對(duì)情況24-31
• 2.1 材料與方法24-26
• 2.1.1 樣品24
• 2.1.2 試驗(yàn)試劑24
• 2.1.3 儀器設(shè)備24
• 2.1.4 樣品采集24-25
• 2.1.5 西農(nóng)薩能奶山羊乳腺組織總RNA的提取及c DNA的合成25
• 2.1.6 山羊不同泌乳時(shí)期乳腺組織中INSIGs的表達(dá)豐度檢測(cè)25-26
• 2.1.7 山羊INSIGs序列生物信息學(xué)分析26
• 2.2 結(jié)果與分析26-29
• 2.2.1 乳腺組織總RNA的提取結(jié)果26-27
• 2.2.2 不同泌乳時(shí)期山羊乳腺組織中INSIGs的表達(dá)情況27
• 2.2.3 山羊INSIG1和INSIG2基因CDS區(qū)的差異27-29
• 2.3 討論29-30
• 2.3.1 不同泌乳時(shí)期山羊乳腺組織中INSIGs表達(dá)豐度的比較29
• 2.3.2 山羊INSIGs兩個(gè)亞型間的序列比較29-30
• 2.4 小結(jié)30-31
• 第三章 超表達(dá)INSIG1對(duì)GMEC中脂代謝的影響研究31-46
• 3.1 材料與方法31-38
• 3.1.1 材料31
• 3.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備31
• 3.1.3 INSIG1基因的擴(kuò)增31-33
• 3.1.4 pAdTrack-CMV-INSIG1腺病毒穿梭載體的構(gòu)建33
• 3.1.5 pAdEasy-INSIG1重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定33-34
• 3.1.6 Ad-INSIG1腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定34-35
• 3.1.7 腺病毒感染GMEC最佳MOI值(multiplicity of infection)的測(cè)定35-36
• 3.1.8 Ad-INSIG1腺病毒超表達(dá)效果檢測(cè)36
• 3.1.9 超表達(dá)INSIG1基因?qū)χ|(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響36
• 3.1.10 超表達(dá)INSIG1基因后GMEC中TAG及TC含量的影響36-37
• 3.1.11 超表達(dá)INSIG1基因?qū)MEC中脂滴積累的影響37-38
• 3.2 結(jié)果與分析38-43
• 3.2.1 INSIG1基因的擴(kuò)增與鑒定38
• 3.2.2 pAdTrack-CMV-INSIG1腺病毒穿梭載體的構(gòu)建與鑒定38-39
• 3.2.3 pAdEasy-INSIG1重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定39-40
• 3.2.4 腺病毒的包裝、擴(kuò)增與滴度測(cè)定40
• 3.2.5 腺病毒感染GMEC最佳MOI值的確定40-41
• 3.2.6 Ad-INSIG1腺病毒超表達(dá)效果檢測(cè)41
• 3.2.7 超表達(dá)INSIG1基因?qū)χ|(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響41-42
• 3.2.8 超表達(dá)INSIG1基因?qū)?xì)胞中TAG、TC含量的影響42-43
• 3.2.9 超表達(dá)INSIG1基因?qū)?xì)胞中脂滴積累的影響43
• 3.3 討論43-45
• 3.3.1 Ad-INSIG1超表達(dá)腺病毒的包裝43-44
• 3.3.2 超表達(dá)INSIG1基因?qū)MEC中脂代謝相關(guān)基因的影響44-45
• 3.3.3 超表達(dá)INSIG1基因?qū)MEC中脂滴積累的影響45
• 3.4 小結(jié)45-46
• 第四章 超表達(dá)INSIG2對(duì)GMEC中脂代謝的影響研究46-57
• 4.1 材料與方法46-49
• 4.1.1 試驗(yàn)材料46
• 4.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備46
• 4.1.3 INSIG2基因的擴(kuò)增46-47
• 4.1.4 pAdTrack-CMV-INSIG2腺病毒穿梭載體的構(gòu)建47
• 4.1.5 pAdEasy-INSIG2重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定47-48
• 4.1.6 Ad-INSIG2腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定48
• 4.1.7 腺病毒感染GMEC最佳MOI值(multiplicity of infection)的測(cè)定48
• 4.1.8 Ad-INSIG2腺病毒超表達(dá)效果檢測(cè)48
• 4.1.9 超表達(dá)INSIG2基因?qū)χ|(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響48
• 4.1.10 超表達(dá)INSIG2基因?qū)MEC中TAG及TC含量的影響48-49
• 4.1.11 超表達(dá)INSIG2基因?qū)MEC中脂滴積累的影響49
• 4.2 結(jié)果與分析49-54
• 4.2.1 INSIG2基因的擴(kuò)增與鑒定49
• 4.2.2 pAdTrack-CMV-INSIG2腺病毒穿梭載體的構(gòu)建與鑒定49-50
• 4.2.3 pAdEasy-INSIG2重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定50-51
• 4.2.4 腺病毒的包裝、擴(kuò)增與滴度測(cè)定51
• 4.2.5 腺病毒感染GMEC最佳MOI值的確定51-52
• 4.2.6 Ad-INSIG2腺病毒超表達(dá)效果檢測(cè)52
• 4.2.7 超表達(dá)INSIG2基因?qū)χ|(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響52-53
• 4.2.8 超表達(dá)INSIG2基因?qū)?xì)胞中TAG、TC含量的影響53-54
• 4.2.9 超表達(dá)INSIG2基因?qū)?xì)胞中脂滴積累的影響54
• 4.3 討論54-56
• 4.3.1 Ad-INSIG2超表達(dá)腺病毒的包裝54-55
• 4.3.2 超表達(dá)INSIG2基因?qū)MEC中脂代謝相關(guān)基因的影響55
• 4.3.3 超表達(dá)INSIG2基因?qū)MEC中脂質(zhì)積累的影響55-56
• 4.4 小結(jié)56-57
• 第五章 干擾INSIGs對(duì)GMEC中脂代謝的影響研究57-66
• 5.1 材料與方法57-59
• 5.1.1 試驗(yàn)試劑57
• 5.1.2 儀器設(shè)備57
• 5.1.3 奶山羊INSIGs基因si RNA的設(shè)計(jì)與合成57-58
• 5.1.4 siRNA干擾效率檢測(cè)58
• 5.1.5 干擾INSIGs基因的表達(dá)對(duì)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響58-59
• 5.1.6 干擾INSIGs基因的表達(dá)對(duì)GMEC中TAG及TC含量的影響59
• 5.1.7 干擾INSIGs基因的表達(dá)對(duì)GMEC中脂滴積累的影響59
• 5.2 結(jié)果與分析59-63
• 5.2.1 siRNA干擾效率檢測(cè)59-61
• 5.2.2 干擾INSIGs基因的表達(dá)對(duì)脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響61
• 5.2.3 干擾INSIGs基因的表達(dá)對(duì)GMEC中TAG及TC含量的影響61-62
• 5.2.4 干擾INSIGs基因的表達(dá)對(duì)GMEC中脂滴積累的影響62-63
• 5.3 討論63-65
• 5.3.1 siRNA的設(shè)計(jì)63-64
• 5.3.2 干擾INSIGs基因的表達(dá)對(duì)脂代謝相關(guān)基因的影響64
• 5.3.3 干擾INSIGs基因的表達(dá)對(duì)脂質(zhì)積累的影響64-65
• 5.4 小結(jié)65-66
• 結(jié)論66-67
• 縮略詞67-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 附錄 174-75
• 附錄 275-76
• 附錄 376-77
• 致謝77-78
• 作者簡(jiǎn)介78

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本文編號(hào)：342884