本文關(guān)鍵詞：對(duì)東方粘蟲(chóng)V-ATPase具有基因沉默功能的昆蟲(chóng)桿狀病毒的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：RNAi技術(shù)是一種高特異性保守的干擾手段,是防治害蟲(chóng)的全新的策略,V-ATP酶在昆蟲(chóng)體內(nèi)起著非常重要的作用,與機(jī)體的生命活動(dòng)有著密切的聯(lián)系。本研究從已知序列中設(shè)計(jì)合成并篩選出具有干擾效果的siRNA序列,構(gòu)建具有基因沉默效應(yīng)的桿狀病毒。這是一種將siRNA與V-ATP酶與昆蟲(chóng)桿狀病毒相結(jié)合,防治東方粘蟲(chóng)的策略。具體如下:1.根據(jù)V-ATP酶的B亞基基因序列,設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了3條siRNA,通過(guò)注射法將片段注射入東方粘蟲(chóng)體內(nèi),利用q-PCR技術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示si2的干擾效果(相對(duì)表達(dá)量為42.53%)較好,選用si2作為構(gòu)建載體的序列;2.轉(zhuǎn)染,將小鼠的U6啟動(dòng)子與shRNA構(gòu)建到昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體pBacPAK9中,篩選出對(duì)東方粘蟲(chóng)有沉默功能的重組病毒;3.病毒繼續(xù)在sf21細(xì)胞中培養(yǎng),傳代至15代,通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)重組的基因,并測(cè)序,結(jié)果顯示重組的桿狀病毒表達(dá)載體具有良好的遺傳穩(wěn)定性;4.用重組的桿狀病毒飼喂3齡的東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng),q-PCR檢測(cè),結(jié)果表明從第3天開(kāi)始,B亞基基因的相對(duì)表達(dá)量明顯下降(37.60%),這充分的表明病毒在供試蟲(chóng)體內(nèi)繁殖并表達(dá)。本研究成功的構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)siRNA的昆蟲(chóng)桿狀病毒,實(shí)現(xiàn)了基因沉默,得到了能夠穩(wěn)定遺傳的重組桿狀病毒,為生物防治提供了新手段。
【關(guān)鍵詞】：東方粘蟲(chóng) V-ATP酶 RNAi 重組桿狀病毒
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.4
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-21
• 1.1 前言10
• 1.2 RNAi10-12
• 1.2.1 RNA干擾的發(fā)現(xiàn)10
• 1.2.2 RNA干擾的作用機(jī)制10-11
• 1.2.3 RNA干擾的特點(diǎn)11-12
• 1.3 昆蟲(chóng)RNA干擾的方法12-13
• 1.4 RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用13-15
• 1.4.1 在基因治療及功能上的應(yīng)用13-14
• 1.4.2 RNAi技術(shù)在植物改良中的應(yīng)用14
• 1.4.3 RNA干擾技術(shù)在昆蟲(chóng)防治中的應(yīng)用14-15
• 1.5 RNAi技術(shù)在防治昆蟲(chóng)上的問(wèn)題及展望15-16
• 1.6 東方粘蟲(chóng)16-17
• 1.6.1 粘蟲(chóng)的危害16
• 1.6.2 粘蟲(chóng)的生物防治16-17
• 1.7 昆蟲(chóng)桿狀病毒17-18
• 1.8 V-ATP酶18-20
• 1.8.1 V-ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能18-19
• 1.8.2 昆蟲(chóng)中V-ATP酶的研究進(jìn)展19-20
• 1.9 研究目的及意義20-21
• 第二章 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建21-32
• 2.1 前言21
• 2.2 材料與方法21-22
• 2.2.1 供試蟲(chóng)源與試劑儀器21
• 2.2.2 提取質(zhì)粒21-22
• 2.2.3 膠回收22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 2.3.1 siRNA的設(shè)計(jì)22-23
• 2.3.2 顯微注射23-24
• 2.3.3 定量結(jié)果分析24
• 2.4 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與合成24-25
• 2.5 合成pBacPAK9(b/b-)-U6-shRNA-B25
• 2.6 細(xì)胞培養(yǎng)25-27
• 2.6.1 凍存26
• 2.6.2 復(fù)蘇26
• 2.6.3 傳代26-27
• 2.7 轉(zhuǎn)染并重組病毒表達(dá)載體27-30
• 2.7.1 噬斑實(shí)驗(yàn)28-29
• 2.7.2 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建29
• 2.7.3 重組桿狀病毒29-30
• 2.8 結(jié)論與討論30-32
• 第三章 重組桿狀病毒載體穩(wěn)定性與干擾效果檢測(cè)32-37
• 3.1 前言32
• 3.2 材料與試劑32-33
• 3.2.1 主要材料32
• 3.2.2 主要儀器32
• 3.2.3 Trizol提取RNA32-33
• 3.3 桿狀病毒遺傳穩(wěn)定性33
• 3.4 桿狀病毒對(duì)東方粘蟲(chóng)的干擾效果檢測(cè)33-34
• 3.5 結(jié)果分析34-35
• 3.5.1 桿狀病毒遺傳穩(wěn)定性34-35
• 3.5.2 對(duì)東方粘蟲(chóng)的干擾效果檢測(cè)35
• 3.6 結(jié)論與討論35-37
• 參考文獻(xiàn)37-43
• 縮略詞43-44
• 致謝44-45
• 作者簡(jiǎn)介45

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