為克隆羊源類鼻疽伯克霍爾德菌BPSS1512基因,并對其編碼的蛋白進行生物信息學(xué)分析,以類鼻疽伯克霍爾德菌基因組為模板,參照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因組DNA序列（登錄號:NC₀06351.1）設(shè)計引物,PCR擴增BPSS1512基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒,SDS-PAGE和Western blotting分析其蛋白表達,DNAMAN等軟件對BPSS1512基因編碼的氨基酸序列進行分析。結(jié)果顯示,PCR擴增成功得到1 425bp的特異性條帶,BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后得到約為5 000和1 500bp的條帶,表明重組質(zhì)粒pET-28a-BPSS1512構(gòu)建成功,IPTG濃度為10mmol/L,誘導(dǎo)時間8h為最適宜的誘導(dǎo)條件。BPSS1512基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53ku,在包涵體中表達;在BPSS1512蛋白二級結(jié)構(gòu)中,α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)卷曲分別占24.05%、14.77%、61.18%,并且疏水性區(qū)域分布在-2.0⁺2.4之間,說明BPSS1512蛋白具有較強的疏水性,本試驗結(jié)... 

【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2017,44(08)北大核心

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圖１ＢＰＳＳ１５１２基因ＰＣＲ產(chǎn)物凝膠電泳檢測Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｇｅｎｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃ－

８期曹瑞勇等：羊源類鼻疽伯克霍爾德菌ＢＰＳＳ１５１２基因克壟原核表達及其蛋白的生物信息學(xué)分析２．６．２ＢＰＳＳ１５１２蛋白疏水性分析用ＢｉｏＥｄｉｔ軟件對目的基因編碼的氨基酸序列進行Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ平均疏水性輪廓分析。曲線的分值越低，其親水性越高，ＢＰＳＳ１５１２蛋白大部分疏水性區(qū)域分布在－２．０～＋２．４范圍之間（圖８），說明了ＢＰＳＳ１５１２蛋白具有較強的疏水性。圖８ＢＰＳＳ１５１２蛋白疏水性分析Ｆｉｇ．８ＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｐｒｏｔｅｉｎ３討論類鼻疽病臨床表現(xiàn)多樣，在微生物診斷條件有限的地區(qū)確診極其困難，死亡率較高，具有廣譜耐藥、復(fù)發(fā)率高等特點［１４－１５］，廣泛流行于非洲東南部和澳大利亞北部，其病原菌可通過多種途徑感染人和動物。類鼻疽病病原菌———類鼻疽伯克霍爾德菌已被美國ＣＤＣ列為Ⅰ類病原菌。有調(diào)查表明，５０％的類鼻疽伯克霍爾德菌感染者本身患有糖尿病，并且被感染者經(jīng)常發(fā)生敗血性休克和肺炎［１５］，由于其病原菌固有的抗藥性使抗生素治療效果不佳，目前尚無有效的疫苗預(yù)防此病［１６］。中國海南是類鼻疽病的高發(fā)地區(qū)，加強類鼻疽病防制對其公共衛(wèi)生安全具有重大意義［１７－１９］。ＢＰＳＳ１５１２基因編碼的類鼻疽伯克霍爾德菌泛酸蛋白酵素ＴｓｓＭ在宿主細胞內(nèi)分泌，可以抑制宿主的先天免疫應(yīng)答［１９］。與該基因相連的Ｔ６ＳＳ基因簇是ＶｉｒＡＧ毒力調(diào)節(jié)子的一部分，編碼的蛋白包含一個泛素特異性的蛋白酶結(jié)構(gòu)域（肽酶Ｃ１９Ｅ家族），其進入宿主細胞后可能干擾泛素蛋白降

構(gòu)預(yù)測；用ＢｉｏＥｄｉｔ軟件進行Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ平均疏水性輪廓分析。２結(jié)果２．１ＰＣＲ擴增與克隆以類鼻疽伯克霍爾德菌基因組為模板進行ＰＣＲ反應(yīng)，對擴增產(chǎn)物進行１．０％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，ＰＣＲ擴增得到１４２５ｂｐ的特異性條帶（圖１），與目的條帶大小相符。測序結(jié)果顯示，該片段與ＧｅｎＢａｎｋ中收錄的Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｓｅｕｄ－ｏｍａｌｌｅｉＫ９６２４３株基因組ＢＰＳＳ１５１２基因序列同源性為９９％。圖１ＢＰＳＳ１５１２基因ＰＣＲ產(chǎn)物凝膠電泳檢測Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｇｅｎｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃ－ｔｉｏｎ２．２酶切鑒定ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２重組質(zhì)粒將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２轉(zhuǎn)化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）感受態(tài)細胞，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ雙酶切，得到約為５０００和１５００ｂｐ的條帶（圖２）。經(jīng)測序證明ＢＰＳＳ１５１２基因已被成功連接到ｐＥＴ－２８ａ質(zhì)粒中，即ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。２．３ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２的誘導(dǎo)表達重組質(zhì)粒ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２分別用０．００１、０．０１、０．１、１、１０ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ３７℃誘導(dǎo)６ｈ，經(jīng)１２．０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測發(fā)現(xiàn)，重組蛋白表達量２２３６

【參考文獻】：
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本文編號：3405170