棉花是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物,在國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展中占有重要地位。早衰和非生物脅迫是限制棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物葉片衰老和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,但是參與調(diào)控棉花葉片衰老和非生物脅迫的WRKY轉(zhuǎn)錄因子知之甚少。前人對棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了全基因組鑒定與分析,結(jié)合葉片衰老轉(zhuǎn)錄組和各種脅迫處理表達(dá)譜數(shù)據(jù),篩選到在葉片衰老和非生物脅迫中上調(diào)表達(dá)的GhWRKY27/42/91基因。本研究旨在從棉花中克隆得到GhWRKY27/42/91基因并分析其功能,主要內(nèi)容和結(jié)論如下:1.衰老上調(diào)表達(dá)的GhWRKY27基因的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥衰老提前,葉綠素含量降低,衰老相關(guān)基因表達(dá)升高。轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)表明GhWRKY27沒有自激活活性。酵母雙雜交文庫篩選到67個GhWRKY27的潛在互作蛋白,酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)表明GhWRKY27與潛在互作蛋白MYB轉(zhuǎn)錄因子GhTT2相互作用。酵母單雜交和凝膠阻滯電泳結(jié)果顯示GhWRKY27可以直接結(jié)合細(xì)胞色素P450 94C1（GhCYP94C1）和成熟相關(guān)蛋白2（GhRipen2-2）的啟動子并在雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中激活它們... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

陸生植物基因家族分類(Chenetal.,2018)

與 pGBKT7-GhWRKY27 質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)到酵母感受態(tài)細(xì)胞 Y2HGold 中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在 SD-TL平板上 30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 3-5 天（如前 2.1.8.6 所述）。然后挑取單克隆，稀釋后點(diǎn)在 SD-TL和 SD-TLHA/X/AbA 的培養(yǎng)平板上。質(zhì)粒 pGADT7-largeT 和 pGBKT7-p53 共轉(zhuǎn)的酵母作為陽性對照，pGADT7-largeT 和 pGBKT7-laminC 共轉(zhuǎn)的酵母作為陰性對照。候選基因構(gòu)建載體的引物序列如下（上下游引物的選取的酶切位點(diǎn)均分別為 EcoRⅠ和 BamHⅠ）：GhBTF3-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGAACAAGGAGAGGCT-3′（Gh_A08G2018）GhBTF3-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCCTATTTAGCAGCTTGGCC-3′GhTT2-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGGGGAGGAGGCCTT-3′（Gh_A07G0140）GhTT2-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCTTAGTTGATCCATTCATCTTCA-3′GhRD21A-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGGGTTCTCAGGGATC-3′（Gh_D01G1044）GhRD21A-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCTCAATGTGCCCAGAACG-3′2.1.10 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）2.1.10.1 載體的構(gòu)建PCR 擴(kuò)增 GhWRKY27 以及三個候選基因 BTF3、RD21A 和 TT2 的 cDNA 全長序列，選擇合適的酶切位點(diǎn)，分別構(gòu)建到表達(dá)載體 pUC-SPYNE 和 pUC-SPYCE 上，載體信息如圖 2.1。

圖 2.2 pGreenII 62-SK 和 pGreenII 0800-LUC 載體信息(Hellens et al., 2005)Figure 2.2 The information of pGreenII 62-SK and pGreenII 0800-LUC vectors (Hellens et al., 2005)2.1.13.2 載體的構(gòu)建克隆 GhWRKY27 轉(zhuǎn)錄因子的 cDNA 序列，構(gòu)建到 effector 載體 pGreenII 62-SK 上，所用引物為（上下游引物酶切位點(diǎn)分別為 BamHⅠ和 XhoⅠ）：SK-WRKY27-F：5′-AGAACTAGTGGATCCATGGAGAACATGTGGAAGTG-3′SK-WRKY27-R：5′-GGGCCCCCCCTCGAGTTAGGAGAAAAATCCCGGTG-3′SK-TT2-F：5′-AGAACTAGTGGATCCATGGGGAGGAGGCCTTGCTGT-3′SK-TT2-R：5′-GGGCCCCCCCTCGAGTTAGTTGATCCATTCATCTTCA-3′克隆 GhCYP94C1 和 GhRipen2-2 的啟動子序列至 reporter 載體 pGreenII 0800-LUC 上，所用引物為（上下游引物酶切位點(diǎn)分別為 XhoⅠ和 BamHⅠ）：LUC-CYP94C1-F：5′-GGGCCCCCCCTCGAGACTACCCAATACTCAGTAGATC-3′LUC-CYP94C1-R：5′-AGAACTAGTGGATCCTTTGATTGATGGAAAGAAAATAAG-3′LUC-Ripen2-2-F：5′-GGGCCCCCCCTCGAGGGACCAAATAAAAATGCTAAAAC-3′LUC-Ripen2-2-R：5′-AGAACTAGTGGATCCCTTGAATTTCTTTTGTTAAATCTTT-3′將擴(kuò)增片段膠回收（如前 2.1.7.2 所述），回收產(chǎn)物構(gòu)建分別連接到相應(yīng)的載體上（如前 2.1.7.3所述）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]棉花衰老相關(guān)WRKY基因的克隆與功能分析[D]. 竇玲玲.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016

碩士論文
[1]棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因鑒定、表達(dá)分析和WRKY46功能研究[D]. 戴鶴.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]陸地棉抗旱相關(guān)基因（GhTrx、GhGR）克隆及其功能分析[D]. 宋貴方.河南大學(xué) 2012



本文編號：3392977