目的:有文獻提示自身免疫肺氣腫大鼠CD4⁺T淋巴細胞穿孔素基因啟動子區(qū)域處于低甲基化狀態(tài)同時伴有肺泡隔細胞凋亡,推測上述區(qū)域的低甲基化狀態(tài)可能誘導自身免疫肺氣腫大鼠肺泡隔細胞凋亡的形成。為探討二者的關系,我們將體外穿孔素啟動子區(qū)低甲基化處理的CD4⁺T淋巴細胞注射到正常大鼠腹腔中,觀察其肺泡隔細胞凋亡及肺組織病理的改變,為進一步研究肺氣腫的發(fā)病機制及尋找新的治療方法提供思路。方法:將30只健康清潔級SD大鼠隨機分為模型組、對照組、假手術組。模型組:分選出正常SD大鼠脾臟CD4⁺T淋巴細胞,加入含有甲基化抑制劑5-氮胞苷（5-Azacytidine,5-Aza）的細胞培養(yǎng)基中（5-Aza濃度:10μmol/l）孵育72小時,取1×10⁷個細胞離心去上清,加完全弗氏佐劑1ml及磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline,PBS）1ml,腹腔注射其他正常SD大鼠1次,該組大鼠設為模型組,另取上述未打入大鼠體內的1×10⁷個細胞檢測上述區(qū)域甲基化水平,設為細胞組1... 

【文章來源】：遵義醫(yī)科大學貴州省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【圖文】：

VEGF陽性對照（IHC二步法,×400）

遵義醫(yī)科大學碩士學位論文劉佳嘉14OD值。1.5.6免疫組化二步法測肺組織VEGF表達（1）肺組織病理切片放在60℃的溫箱中2h使石蠟融化，經二甲苯及酒精脫水后予蒸餾水沖洗。（2）用檸檬酸抗原修復緩沖液進行標本抗原修復，加熱8min后轉小火7min，室溫降溫后予PBS清洗。（3）標本于3%H2O2常溫下黑暗中靜置25min后用PBS清洗；在組織表面滴加3%BSA封閉30min。（4）去除3%BSA后滴加VEGF一抗，4°C靜置一夜。（5）PBS清洗切片，適當甩干切片后在組織表面滴加Peroxidase-ConjugatedGoatAnti-RabbitIgG二抗，常溫下孵育50min。（6）PBS清洗切片后烘干標本片，添加二氨基聯(lián)苯胺溶液（Diaminobenzidine，DAB），標本顯色后予流動水沖洗。（7）蘇木素復染，脫水封片。（8）光鏡下鏡檢，采用雙盲法采集圖像進行分析。VEGF陽性表達呈棕黃色或棕褐色，定位在血管內皮細胞、支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞的胞漿內[28]，陽性對照（圖1-1）光鏡下可見細胞胞漿被染色，即為VEGF陽性表達，而陰性對照（圖1-2，未加VEGF一抗）未見明顯染色。參照文獻方法，在高倍顯微鏡下（400倍），每張標本片隨機選取3個視野，通過Imageproplus6.0得到每個視野中陽性蛋白的平均光密度值[29,30]。VEGF圖1-1VEGF陽性對照（IHC二步法,×400）AVEGFVEGF圖1-2VEGF陽性對照（IHC二步法,×400）

遵義醫(yī)科大學碩士學位論文劉佳嘉161.5.8大鼠脾臟淋巴細胞分離（1）于超凈工作臺內進行無菌操作。（2）用無菌鑷子及眼科剪清除脾臟表面的包膜等其他組織，PBS洗凈后用眼科剪把脾臟剪至1mm3小塊。（3）將所有脾臟轉移到200目細胞篩內，篩下放置一無菌培養(yǎng)皿，用10ml注射器活塞小心研磨剪碎的脾臟組織，研磨過程中分次加入大鼠淋巴細胞分離液共5-6ml，使研磨分散下來的單細胞通過細胞篩進入培養(yǎng)皿，研磨5min。（2）把所有分離液轉移到離心管內，輕輕覆蓋1ml1640培養(yǎng)基，800g/min離心30min，離心后可見液體分為四層，從上至下第二層是淋巴細胞層，小心吸取該層細胞至15ml離心管，加入10ml1640培養(yǎng)液以300g/min離心10min。（5）棄掉上清后再次予PBS離心洗滌細胞計數(shù)。1.5.9磁珠分選大鼠脾臟CD4+T淋巴細胞（按Miltenyi說明書進行操作）（1）制備1×108～1×109/ml單細胞懸液，取100ul重懸于80ul的Buffer中，添加20ul磁珠，手動彈打以混合均勻標本，置于4℃冰箱15min。（2）加入2mlBuffer充分混合均勻，300g/min離心10min。（3）吸出上清液后加入500ulBuffer以重懸細胞。（4）擺好磁珠架和離心管的高度，固定LS陽性分選柱。（5）取3mlBuffer潤洗LS柱，盡可能避免出現(xiàn)氣泡。（6）Buffer快滴完時加樣于分選柱中央，3mlBuffer清洗標本管后加入柱中，清洗3圖1-3凋亡陽性對照光鏡（×400）圖1-4凋亡陰性對照光鏡（×400）凋亡細胞凋亡細胞

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3391902