目的:有文獻(xiàn)提示自身免疫肺氣腫大鼠CD4⁺T淋巴細(xì)胞穿孔素基因啟動(dòng)子區(qū)域處于低甲基化狀態(tài)同時(shí)伴有肺泡隔細(xì)胞凋亡,推測(cè)上述區(qū)域的低甲基化狀態(tài)可能誘導(dǎo)自身免疫肺氣腫大鼠肺泡隔細(xì)胞凋亡的形成。為探討二者的關(guān)系,我們將體外穿孔素啟動(dòng)子區(qū)低甲基化處理的CD4⁺T淋巴細(xì)胞注射到正常大鼠腹腔中,觀察其肺泡隔細(xì)胞凋亡及肺組織病理的改變,為進(jìn)一步研究肺氣腫的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療方法提供思路。方法:將30只健康清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、假手術(shù)組。模型組:分選出正常SD大鼠脾臟CD4⁺T淋巴細(xì)胞,加入含有甲基化抑制劑5-氮胞苷（5-Azacytidine,5-Aza）的細(xì)胞培養(yǎng)基中（5-Aza濃度:10μmol/l）孵育72小時(shí),取1×10⁷個(gè)細(xì)胞離心去上清,加完全弗氏佐劑1ml及磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline,PBS）1ml,腹腔注射其他正常SD大鼠1次,該組大鼠設(shè)為模型組,另取上述未打入大鼠體內(nèi)的1×10⁷個(gè)細(xì)胞檢測(cè)上述區(qū)域甲基化水平,設(shè)為細(xì)胞組1... 

【文章來(lái)源】：遵義醫(yī)科大學(xué)貴州省

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【圖文】：

VEGF陽(yáng)性對(duì)照（IHC二步法,×400）

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文劉佳嘉14OD值。1.5.6免疫組化二步法測(cè)肺組織VEGF表達(dá)（1）肺組織病理切片放在60℃的溫箱中2h使石蠟融化，經(jīng)二甲苯及酒精脫水后予蒸餾水沖洗。（2）用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行標(biāo)本抗原修復(fù)，加熱8min后轉(zhuǎn)小火7min，室溫降溫后予PBS清洗。（3）標(biāo)本于3%H2O2常溫下黑暗中靜置25min后用PBS清洗；在組織表面滴加3%BSA封閉30min。（4）去除3%BSA后滴加VEGF一抗，4°C靜置一夜。（5）PBS清洗切片，適當(dāng)甩干切片后在組織表面滴加Peroxidase-ConjugatedGoatAnti-RabbitIgG二抗，常溫下孵育50min。（6）PBS清洗切片后烘干標(biāo)本片，添加二氨基聯(lián)苯胺溶液（Diaminobenzidine，DAB），標(biāo)本顯色后予流動(dòng)水沖洗。（7）蘇木素復(fù)染，脫水封片。（8）光鏡下鏡檢，采用雙盲法采集圖像進(jìn)行分析。VEGF陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色，定位在血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)[28]，陽(yáng)性對(duì)照（圖1-1）光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞漿被染色，即為VEGF陽(yáng)性表達(dá)，而陰性對(duì)照（圖1-2，未加VEGF一抗）未見(jiàn)明顯染色。參照文獻(xiàn)方法，在高倍顯微鏡下（400倍），每張標(biāo)本片隨機(jī)選取3個(gè)視野，通過(guò)Imageproplus6.0得到每個(gè)視野中陽(yáng)性蛋白的平均光密度值[29,30]。VEGF圖1-1VEGF陽(yáng)性對(duì)照（IHC二步法,×400）AVEGFVEGF圖1-2VEGF陽(yáng)性對(duì)照（IHC二步法,×400）

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文劉佳嘉161.5.8大鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離（1）于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌操作。（2）用無(wú)菌鑷子及眼科剪清除脾臟表面的包膜等其他組織，PBS洗凈后用眼科剪把脾臟剪至1mm3小塊。（3）將所有脾臟轉(zhuǎn)移到200目細(xì)胞篩內(nèi)，篩下放置一無(wú)菌培養(yǎng)皿，用10ml注射器活塞小心研磨剪碎的脾臟組織，研磨過(guò)程中分次加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液共5-6ml，使研磨分散下來(lái)的單細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞篩進(jìn)入培養(yǎng)皿，研磨5min。（2）把所有分離液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，輕輕覆蓋1ml1640培養(yǎng)基，800g/min離心30min，離心后可見(jiàn)液體分為四層，從上至下第二層是淋巴細(xì)胞層，小心吸取該層細(xì)胞至15ml離心管，加入10ml1640培養(yǎng)液以300g/min離心10min。（5）棄掉上清后再次予PBS離心洗滌細(xì)胞計(jì)數(shù)。1.5.9磁珠分選大鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞（按Miltenyi說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作）（1）制備1×108～1×109/ml單細(xì)胞懸液，取100ul重懸于80ul的Buffer中，添加20ul磁珠，手動(dòng)彈打以混合均勻標(biāo)本，置于4℃冰箱15min。（2）加入2mlBuffer充分混合均勻，300g/min離心10min。（3）吸出上清液后加入500ulBuffer以重懸細(xì)胞。（4）擺好磁珠架和離心管的高度，固定LS陽(yáng)性分選柱。（5）取3mlBuffer潤(rùn)洗LS柱，盡可能避免出現(xiàn)氣泡。（6）Buffer快滴完時(shí)加樣于分選柱中央，3mlBuffer清洗標(biāo)本管后加入柱中，清洗3圖1-3凋亡陽(yáng)性對(duì)照光鏡（×400）圖1-4凋亡陰性對(duì)照光鏡（×400）凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3391902