灰樹花（Grifola frondosa）作為食藥兼用蕈菌,富含多糖、蛋白和微量元素等營養(yǎng)成分。研究表明,灰樹花多糖,特別是葡聚糖,具有顯著的抗腫瘤、免疫增強、降血糖等功能。本課題組前期已開展了灰樹花多糖結(jié)構(gòu)解析、功能評價及其合成途徑等研究,推測灰樹花葡聚糖合成主要依賴UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase of G.frondosa,GFUGP）合成UDP-葡萄糖,并由葡聚糖合成酶聚合而成。然而,有關(guān)GFUGP在灰樹花菌體生長和多糖合成過程中的功能和作用的研究還未見報道。因此,在前期研究的基礎(chǔ)上,本論文基于NCBI數(shù)據(jù)庫公布的灰樹花全基因組序列,克隆測序gfugp,并對其進行全面的生物信息學(xué)分析,并通過構(gòu)建gfugp沉默菌株分析沉默gfugp對灰樹花菌體形態(tài)、菌體/多糖產(chǎn)量、多糖組成及其合成途徑中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,以期探明GFUGP在灰樹花發(fā)酵過程中菌絲體生長和多糖合成中的主要功能。（1）灰樹花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp的克隆和生物信息學(xué)分析�？寺y序并重新注釋了灰樹花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp,其gDNA全... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

葡萄糖為底物的細菌EPS生物合成示意圖

灰樹花多糖合成途徑中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因結(jié)構(gòu)與功能研究6變化。1.3.3UGP蛋白進化分析吳曉俊等[30]研究發(fā)現(xiàn)，大麥、馬鈴薯、擬南芥的UGP同源性85%，植物（大麥、馬鈴薯、擬南芥）與酵母菌、牛的UGP之間同源性約為55%；而與大腸桿菌UGP僅有18%的同源性。真核生物UGP較大，如大麥UGP含有473個氨基酸殘基，酵母UGP中有699個氨基酸殘基，而原核生物UGP較小，約有300個氨基酸殘基。由圖1.2可知，真核生物與原核生物UGP同源性很低，這說明真核生物UGP在進化早期就已經(jīng)獨立進化[31]。圖1.2UGP及相關(guān)蛋白進化分支圖（Kleczkowski.etal.2004）Figure1.2EvolutionbranchofUGPandrelatedproteins(Kleczkowski.etal.2004)1.3.4UGP亞細胞定位UGP廣泛地存在于各個物種及其組織中。亞細胞定位表明細胞質(zhì)、膜組分與微粒（高爾基體/葉綠體）等均含有UGP。RNA提取和免疫蛋白雜交實驗的結(jié)果表明，ugp在馬鈴薯的塊莖、地上莖、葉片等組織中均有表達，且UGP在生長中的塊莖含量最高[32]。Kim等[33]發(fā)現(xiàn)，大米UGP大多數(shù)分布在細胞質(zhì)，少量存在于高爾基體和造粉體等部位，Kimura等[34]利用免疫金標記也觀察到大米類似的UGP分布情況。UGP的分布情況、基因表達水平與生物體生長代謝息息相關(guān)。比如，Riellahelicophylla根部從生長點至成熟區(qū)均存在UGP，并且伸長區(qū)和成熟區(qū)的UGP活性最高[35]。有研究報道，在擬南芥中UGP活性較高的是葉綠體[36]，大麥細胞則是細胞膜[37]。在細胞膜上存在高活性UGP，提示著

灰樹花多糖合成途徑中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因結(jié)構(gòu)與功能研究22葡萄糖焦磷酸化酶的基因序列。圖2.1引物為gfugp-F、gfugp-R擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2.1Electrophoresisofamplifiedproductsusedgfugp-Fandgfugp-Rprimers.M為DL5000marker，指示條帶為1000bp；泳道1至3為利用引物gfUGP-F、gfUGP-R進行PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物凝膠電泳條帶。圖2.2擴增序列(3490bp)的啟動子分析預(yù)測Figure2.2Promoteranalysispredictionofamplifiedfragment(3490bp)2.4.2灰樹花gfugp生物信息學(xué)分析2.4.2.1灰樹花gfugp基因內(nèi)外顯子分析通過FGENESH軟件分析表明，灰樹花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp含有10個內(nèi)含子及11個外顯子（圖2.3A），編碼灰樹花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶GFUGP的cDNA序列全長為1392bp。2.4.2.2灰樹花gfugp氨基酸序列與功能域分析DNAMAN軟件預(yù)測gfugp編碼的氨基酸序列（附錄2）。Gfugp含有一個完整的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA；該基因的編碼框（CDS）共編碼463個氨基酸。分析GFUGP蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其具有一個UGPase特征功能域（圖2.3B），位于氨基酸殘基50~428，并且在氨基酸殘基103~311具有16處底物結(jié)合位點。在線軟件Phobius與SignalP4.0預(yù)測GFUGP無跨膜信號肽，GFUGP酶定位于

【參考文獻】：
期刊論文
[1]α-PGM過表達對靈芝多糖發(fā)酵的影響[J]. 李瑞勤,王瓊,沈夢燁,丁重陽,顧正華,張梁,石貴陽.  食品與生物技術(shù)學(xué)報. 2019(11)
[2]酵母UDP-葡萄糖合成途徑的優(yōu)化及黃酮葡萄糖苷的合成[J]. 王惠敏,楊燕,田雷瑜,周文龍,王偉.  中國醫(yī)藥生物技術(shù). 2016(03)
[3]添加氧化鋁對灰樹花菌絲體生長及多糖產(chǎn)量的影響[J]. 陳瀟筱,楊焱,崔鳳杰,孫文敬,劉偉民.  食用菌學(xué)報. 2016(01)
[4]食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史、現(xiàn)狀與趨勢[J]. 張金霞,陳強,黃晨陽,高巍,曲積彬.  菌物學(xué)報. 2015(04)
[5]灰樹花及其藥理作用研究進展[J]. 甘長飛.  食藥用菌. 2014(05)
[6]PEG介導(dǎo)的猴頭菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 劉莉,肖招燕,郭麗瓊,林俊芳,尤琳烽,廖靜文.  菌物學(xué)報. 2014(01)
[7]絲狀真菌形態(tài)控制及其在發(fā)酵過程優(yōu)化中的應(yīng)用[J]. 熊強,徐晴,顧帥,李霜.  生物工程學(xué)報. 2012(02)
[8]灰樹花多糖的提取及抗氧化活性[J]. 顧華杰,沈晨斌,嚴志舟,金琎,王桃云,胡翠英,陳家長.  生物加工過程. 2012(01)
[9]過量表達OsUgp2基因提高紫芝多糖含量[J]. 張帆,鐘威,穆虹,李剛.  菌物學(xué)報. 2011(03)
[10]靈芝多糖的生物合成和發(fā)酵調(diào)控[J]. 劉高強,趙艷,王曉玲,朱朝陽.  菌物學(xué)報. 2011(02)

博士論文
[1]禾谷鐮刀菌細胞壁形成相關(guān)基因及其 RNAi 片段功能鑒定[D]. 宋修仕.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]靈芝碳代謝途徑中UDP葡萄糖焦磷酸化酶和磷酸葡萄糖變位酶基因功能研究[D]. 李夢嬌.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]Paenibacillus elgii B69胞外多糖結(jié)構(gòu)鑒定及生物合成途徑研究[D]. 李歐.浙江大學(xué) 2014
[4]靈芝基因沉默體系的建立及NADPH氧化酶基因家族功能分析[D]. 穆大帥.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013

碩士論文
[1]灰樹花葡聚糖合成酶的基因結(jié)構(gòu)和功能研究[D]. 陶庭磊.江蘇大學(xué) 2019
[2]發(fā)酵環(huán)境影響灰樹花菌絲體生長和多糖合成的研究[D]. 陳瀟筱.江蘇大學(xué) 2016
[3]靈芝菌絲體培養(yǎng)中多糖組分的變化與相關(guān)酶活性分析[D]. 王瓊.江南大學(xué) 2013



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