細(xì)胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）是一類古老的血紅素硫蛋白的超家族基因,廣泛存在于動植物、細(xì)菌、真菌等物種的細(xì)胞內(nèi),參與了生物生長發(fā)育過程中多種物質(zhì)的合成與代謝。研究表明CYP450氧化酶家族基因在植物的抗蟲、抗除草劑等抗性方面具有重要的調(diào)控作用,但在玉米（Zea mays L.）發(fā)育調(diào)控中的作用并不清楚。本研究通過基因編輯技術(shù)造成玉米ZmCYP72A5基因的缺失進(jìn)而研究其在玉米生長發(fā)育中的功能。主要結(jié)果如下:玉米ZmCYP72A5基因位于3號染色體上,基因全長1853 bp,其中編碼區(qū)1581 bp,共編碼526個氨基酸。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示,ZmCYP72A5在N端含有一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個高度保守的P450超家族結(jié)構(gòu)域,包含的氧結(jié)合活性區(qū)、PERF區(qū)和亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)三個區(qū)域為P450超家族特有的功能結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),玉米CYP72A5與其它植物的CYP72A同源蛋白有不同程度上的親緣關(guān)系,與單子葉植物的CYP72A同源性較高,且與高粱CYP72A15的親緣關(guān)系最近,與雙子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。ZmCYP72A5蛋白在玉米原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位結(jié)果... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

玉米開花時間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Dongetal.,2012）

玉米ZmCYP72A5基因的功能研究12盡管CYPs催化的生物化學(xué)反應(yīng)非常不同，但CYPs在結(jié)構(gòu)折疊上通過相似性聯(lián)系在一起。一般折疊包括所有CYP和提供底物特異性的結(jié)構(gòu)域特征（Werck-ReichhartandFeyereisen,2000）。如圖1-3所示，大多數(shù)植物的CYP都有一個膜錨，將它們系在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或葉綠體上，然后是一個鉸鏈結(jié)構(gòu)域。每個CYP包含促進(jìn)與血紅素輔因子和細(xì)胞色素P450還原酶相互作用的結(jié)構(gòu)域，以及促進(jìn)與各種底物相互作用的識別位點。血紅素結(jié)合域是CYP酶家族中最保守的元素，因為它提供半胱氨酸配體，并且具有足夠的剛性來將血紅素固定在適當(dāng)?shù)奈恢霉┭趸�。ExxR區(qū)域的谷氨酸和精氨酸殘基以及PERF區(qū)域的精氨酸在所有的植物CYP中都是保守的，它們似乎能將血紅素囊鎖在適當(dāng)?shù)奈恢�，并穩(wěn)定核心結(jié)構(gòu)（Baketal.,2011）。PERF結(jié)構(gòu)域所在的曲流區(qū)對于蛋白質(zhì)與細(xì)胞色素P450還原酶（Sirimetal.,2010）的相互作用也很重要。該i-螺旋包含保守的殘基，形成一個質(zhì)子溝槽，對于裂解O-O鍵生成活潑的Fe-O羥基化合物至關(guān)重要。底物識別位點（SRSs）是在CYP折疊中具有保守位置的高變區(qū)域，但其氨基酸功能不同，以適應(yīng)不同底物大小和化學(xué)性質(zhì)的（Gotoh,1992）。圖1-3與功能相關(guān)的保守的CYP結(jié)構(gòu)域（Beketal.,2011）Fig.1-3ConservedCYPdomainsrelevanttofunction(Beketal.,2011)1.2.2細(xì)胞色素P450功能研究進(jìn)展CYP450在生物中有兩種存在形式，在原核生物中為可溶性蛋白酶；在真核生物中，則錨定于膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，在細(xì)胞質(zhì)中行使催化功能（Werck-ReichhartandFeyereisen,2000）。多數(shù)植物細(xì)胞色素P450是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白，在氨基酸末端通過疏水性螺旋將其錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其余大部分蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外的胞質(zhì)面（Chapple,1998）。根據(jù)其功能不同可以將CYP450分為兩種主要的類型，一

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文17pyognenes）的CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前應(yīng)用最多和最成熟的系統(tǒng)（Congetal.,2013；Shanetal.,2013)。CRISPR/CasⅡ型系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)見圖1-4。圖1-4細(xì)菌內(nèi)的CRISPR/Cas系統(tǒng)的工作元件和過程（HavathandBarrangou,2010）Fig.1-4OperatingelementsandprocessesofCRISPR/Cassysteminbacteria(HavathandBarrangou,2010)1.5.2CRISPR/Cas9的應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展至今已經(jīng)相對成熟，廣泛應(yīng)用于動植物的細(xì)胞基因編輯，研究人員在應(yīng)用過程中不斷改進(jìn)完善并展開了具有針對性的基因組編輯工作，創(chuàng)制目標(biāo)突變體，進(jìn)行基因組功能的研究。CRISPR基因編輯技術(shù)被譽為“上帝的手術(shù)刀”，提供了一種相對快速且簡單的方法，實現(xiàn)對單個基因的精確刪除、替換和修改。自2012年問世以來，CRISPR技術(shù)在過去幾年里不斷升級，從基礎(chǔ)生物學(xué)研究領(lǐng)域到植物育種、新藥研發(fā)等應(yīng)用領(lǐng)域，已有廣泛的應(yīng)用。Platt教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊基于CRISPR-Cas的工作原理做了技術(shù)創(chuàng)新。CRISPR-Cas技術(shù)需要用到核酸酶Cas和起向?qū)ё饔玫男NA分子。后者的堿基序列相當(dāng)于一個“地址標(biāo)簽集”，把酶精確地指向染色體上的作用位點。使得我們有可能同時修改細(xì)胞內(nèi)的幾十個、乃至上百個基因。迪華農(nóng)業(yè)科技公司借助CRISPR-Cas9技術(shù)開發(fā)了一種新的玉米性狀聚合方法，確定了一系列復(fù)合性狀目標(biāo)插入位點（ComplexTraitLoci,CTL），借助CRISPR-Cas9系統(tǒng)以及Bbm和Wus2基因（提高轉(zhuǎn)化效率）在這些CTL區(qū)域內(nèi)分別精準(zhǔn)地插入包含篩選標(biāo)記和FLP重組酶識別位點的外源片段，從而形成多個獨立的基因聚合玉米受體。每個受體株系均能夠在FLP重組

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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