目的:流感病毒基因組UTR可變區(qū)的堿基多態(tài)性可影響其基因的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和翻譯,從而影響病毒的生物學(xué)特性。本研究利用本課題組前期自主構(gòu)建的RNA聚合酶I EGFP熒光報(bào)告系統(tǒng),即新發(fā)禽流感病毒H5N6/H7N9/H9N2的HA/NA-3’UTR-EGFP-5’UTR隨機(jī)突變庫(kù)。從其中隨機(jī)挑選各亞型的突變克隆,定性及定量分析EGFP基因的表達(dá)情況。測(cè)序鑒定EGFP報(bào)告基因上調(diào)的HA/NA-UTR突變克隆并分析導(dǎo)致EGFP表達(dá)上調(diào)的UTR可變區(qū)特異SNP特征。同時(shí)利用自主構(gòu)建的雙向反向遺傳學(xué)體系包裝H9N2流感病毒和UTR區(qū)突變病毒,測(cè)定并比較其病毒感染力,從而探討流感病毒UTR區(qū)的基因突變對(duì)病毒感染能力變化的影響。方法:1.從隨機(jī)突變庫(kù)中篩選EGFP表達(dá)上調(diào)株:采用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的由HA/NA-UTR隨機(jī)突變RNA聚合酶I熒光報(bào)告系統(tǒng)（HA/NA-3’UTR-EGFP-5’UTR）組成的突變庫(kù),從HA/NA-UTR隨機(jī)突變庫(kù)的H5/H7/H9和N2/N6/N9亞型中分別隨機(jī)挑選突變克隆,將突變克隆轉(zhuǎn)染至由H1N1染毒的MDCK細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察EGFP基因的熒光表達(dá)情況,利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)... 

【文章來(lái)源】：暨南大學(xué)廣東省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：93 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

甲型流感病毒結(jié)構(gòu)示意圖

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文4出以供細(xì)胞質(zhì)核糖體翻譯[23]。甲型流感病毒的蛋白質(zhì)合成完全依賴于宿主細(xì)胞的翻譯機(jī)制。一旦合成病毒RNA，它們就會(huì)通過(guò)核孔進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。核出口之后，病毒mRNA的翻譯分為細(xì)胞質(zhì)核糖體（PB1、PB2、PA、NP、NS1、NS2和M1）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的核糖體（膜蛋白HA、NA和M2）[24]。新合成的NP蛋白和聚合酶亞基（PB1、PB2和PA）上的核定位序列將這些蛋白質(zhì)導(dǎo)向至細(xì)胞核。NP和PB2蛋白是單獨(dú)導(dǎo)入的，而PB1和PA蛋白是作為異二聚體導(dǎo)入的[25,26]。在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，vRNP被基質(zhì)蛋白M1包圍，被導(dǎo)向定位于細(xì)胞質(zhì)膜的出芽位點(diǎn)，用于病毒的組裝[27,28]。HA、NA和M2穿過(guò)反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)后，翻譯過(guò)程在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行。病毒被攜帶HA、NA和離子通道蛋白M2的宿主細(xì)胞衍生的脂質(zhì)膜包裹，這些蛋白質(zhì)被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的頂端表面以從極化細(xì)胞中排出[29]。新組裝的病毒通過(guò)破壞SA以出芽的方式釋放出來(lái)，其依賴于NA的唾液酸酶活性。圖2.甲型流感病毒在宿主細(xì)胞中的生活史Figure2.SchematicdiagramoflifecycleofinfluenzaAvirusinthehostcell.

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文23圖3熒光顯微鏡下H5-UTR突變克隆的綠色熒光蛋白表達(dá)情況Fig.3TheexpressionofH5-UTRmutantclonesonEGFPusingFluorescencemicroscopy圖4熒光顯微鏡下H7-UTR突變克隆的綠色熒光蛋白表達(dá)情況Fig.4TheexpressionofH7-UTRmutantclonesonEGFPusingFluorescencemicroscopy圖5熒光顯微鏡下H9-UTR突變克隆的綠色熒光蛋白表達(dá)情況Fig.5TheexpressionofH9-UTRmutantclonesonEGFPusingFluorescencemicroscopy

【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]甲型流感H5/H7/H9及N2/N6/N9亞型非翻譯區(qū)隨機(jī)突變基因庫(kù)構(gòu)建及篩選[D]. 陳燕慈.暨南大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3376778