壺瓶碎米薺GST-u4基因克隆及表達產(chǎn)物活性初步研究
發(fā)布時間：2021-08-27 00:11
壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis）是十字花科碎米薺屬多年生草本植物,屬于超聚硒植物。硒是人和動物的必需微量元素,因此可以通過從高聚硒植物中獲取對人類有益的有機硒來補硒,而探索壺瓶碎米薺體內(nèi)的硒代謝機制成為當前研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)80mg·mL-1的硒處理壺瓶碎米薺,其葉內(nèi)GST-u4基因表達量顯著增加,推測GST-u4基因與硒螯合作用及液泡貯存有關。本文采用RT-PCR方法克隆了ChGST-u4,利用在線工具對該基因進行了生物信息學分析;并對該基因密碼子優(yōu)化,構建表達載體,熱激轉化大腸桿菌Arctic Express進行表達條件篩選,得到的表達產(chǎn)物經(jīng)純化后通過等溫滴定量熱法對其活性進行了初步研究,為壺瓶碎米薺體內(nèi)硒的代謝機制研究奠定了物質基礎,主要研究結果如下:1、ChGST-u4確系谷胱甘肽硫轉移酶基因家族tau亞家族基因;分子量大小為672bp,該基因編碼224個氨基酸,蛋白質分子質量25.6872kDa,丙氨酸的含量最豐富,占總量的4.9%;理論等電點為6.18,該蛋白沒有信號肽,有9個磷酸化位點;為親水蛋白;ChGST-u4的...
【文章來源】：湖北民族大學湖北省
【文章頁數(shù)】：78 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
壺瓶碎米薺Figure1-1.Cardaminehupingshanensis
第1章文獻綜述-7-65]，還可以利用改變泛素-蛋白酶途徑，修正蛋白質的錯誤折疊，對異型蛋白水解，從而除去硒毒性，使得植物能耐受更高濃度的硒[57]。圖1-2植物硒代謝概要圖[25]Figure1-2.SchematicoverviewofSemetabolisminplants1.3.3硒在植物中的貯藏方式及形態(tài)硒最常見的價態(tài)有-2、0、2、4和6。硒對植物的主要有效形式是無機的，即亞硒酸鹽(SeIV）和硒酸鹽(SeVI)[64]。有機硒主要以硒蛋白、硒多糖及硒核酸為主，還有少量的硒代氨基酸及其衍生物，占總量的80%[66]。人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的植物種類積累了許多含硒的代謝物：硒代甲硫氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(SeCys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMeSeCys)、硒代胱氨酸、谷氧�；谆腚装彼帷⑽阴Ｄ憠A等等(如圖1-3)。但是植物內(nèi)最常見的是硒代甲硫氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(SeCys)和甲基硒代半胱氨酸(SeMeSeCys)。外源硒的形態(tài)和代謝方式?jīng)Q定了硒在植株體內(nèi)的形態(tài)、轉移和分布[67,68]。硒酸鹽進入植物體內(nèi)立即傳遞到木質部多以硒酸根的形式儲存，而亞硒酸鹽在根中迅速轉化為有機硒化合物[40]。如西芹、燈籠草、蒲公英施加硒酸鹽后其體內(nèi)主要硒形態(tài)為硒酸根[69]。如小麥的根系吸收亞硒酸鈉后，大部分的硒積累在根部，主要是在根部代謝轉化為SeMet、SeOMet、MeSeCys等有機態(tài)，而籽粒中以SeMet居多，其次是硒甲基化半胱氨酸和少量的硒代半胱氨酸[45]。通過對香蔥施加硒酸鹽、亞硒酸鹽和有機硒硒代蛋氨酸檢測硒形態(tài)的分布得出，外源硒為硒酸鹽時，
第1章文獻綜述-12-三烯C4的生物合成、抗氧化等方面發(fā)揮重要作用。此外，由于GSTs的高水溶性、在細胞內(nèi)的豐富性和結合特性，GSTs參與了一系列結構多樣的疏水性配體的細胞內(nèi)運輸和儲存，如血紅素、膽紅素、激素、類黃酮、脂肪酸和外源物質[99]。GSTs的催化機制可分為三個步驟(如圖1-4)，即第一步GSH去質子化，親和攻擊親電子底物，在位置1的廣義堿（Tyr6(μ)、Tyr7(π)或Tyr8(α)的-OH）能提高GSH與底物的親和能力，并與其巰基形成氫鍵[93]。第二步，位置2處帶正電的基團催化離去基團的離去，速度較快[100]。對GSH和底物之間的催化反應一般是依序形成酶-GSH-親電子底物三元復合物，GSTsC-末端對于活性不是必需的[100]。圖1-4GSTs的催化機制Fig1-4CatalyticmechanismofGSTs研究發(fā)現(xiàn)藥用野生稻的GST基因對抵御低溫脅迫、稻瘟病菌，重金屬、干旱和高鹽等有重要作用，小麥中的GSTF6基因可增強植株的干旱抗性，擬南芥GST家族中多個GST受到SA和真菌激發(fā)，幾丁質被誘導表達，說明這些基因可能參與了植物的抗病響應[92]。不同種類的GST，位于氨基酸殘端的G位點的功能以及形成的H位點均不同。由于H位點結構影響GST底物的特性，使得GST超家族能催化許多不同結構化合物反應[92]，研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)GST催化花青素與GSH結合，然后在轉運酶的作用下轉運到液泡中或者排除體外，從而降低花青素對自身的毒害[101]。劉海峰、王軍等通過克隆山葡萄中的谷胱甘肽S-轉移酶基因(VAmGST4)，并通過半定量表達分析該基因的表達與花色苷的生物合成密切相關[102]。植物GSTs的“原始”功能很差，因為GSH結合的內(nèi)源性植物底
本文編號：3365244
【文章來源】：湖北民族大學湖北省
【文章頁數(shù)】：78 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
壺瓶碎米薺Figure1-1.Cardaminehupingshanensis
第1章文獻綜述-7-65]，還可以利用改變泛素-蛋白酶途徑，修正蛋白質的錯誤折疊，對異型蛋白水解，從而除去硒毒性，使得植物能耐受更高濃度的硒[57]。圖1-2植物硒代謝概要圖[25]Figure1-2.SchematicoverviewofSemetabolisminplants1.3.3硒在植物中的貯藏方式及形態(tài)硒最常見的價態(tài)有-2、0、2、4和6。硒對植物的主要有效形式是無機的，即亞硒酸鹽(SeIV）和硒酸鹽(SeVI)[64]。有機硒主要以硒蛋白、硒多糖及硒核酸為主，還有少量的硒代氨基酸及其衍生物，占總量的80%[66]。人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的植物種類積累了許多含硒的代謝物：硒代甲硫氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(SeCys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMeSeCys)、硒代胱氨酸、谷氧�；谆腚装彼帷⑽阴Ｄ憠A等等(如圖1-3)。但是植物內(nèi)最常見的是硒代甲硫氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(SeCys)和甲基硒代半胱氨酸(SeMeSeCys)。外源硒的形態(tài)和代謝方式?jīng)Q定了硒在植株體內(nèi)的形態(tài)、轉移和分布[67,68]。硒酸鹽進入植物體內(nèi)立即傳遞到木質部多以硒酸根的形式儲存，而亞硒酸鹽在根中迅速轉化為有機硒化合物[40]。如西芹、燈籠草、蒲公英施加硒酸鹽后其體內(nèi)主要硒形態(tài)為硒酸根[69]。如小麥的根系吸收亞硒酸鈉后，大部分的硒積累在根部，主要是在根部代謝轉化為SeMet、SeOMet、MeSeCys等有機態(tài)，而籽粒中以SeMet居多，其次是硒甲基化半胱氨酸和少量的硒代半胱氨酸[45]。通過對香蔥施加硒酸鹽、亞硒酸鹽和有機硒硒代蛋氨酸檢測硒形態(tài)的分布得出，外源硒為硒酸鹽時，
第1章文獻綜述-12-三烯C4的生物合成、抗氧化等方面發(fā)揮重要作用。此外，由于GSTs的高水溶性、在細胞內(nèi)的豐富性和結合特性，GSTs參與了一系列結構多樣的疏水性配體的細胞內(nèi)運輸和儲存，如血紅素、膽紅素、激素、類黃酮、脂肪酸和外源物質[99]。GSTs的催化機制可分為三個步驟(如圖1-4)，即第一步GSH去質子化，親和攻擊親電子底物，在位置1的廣義堿（Tyr6(μ)、Tyr7(π)或Tyr8(α)的-OH）能提高GSH與底物的親和能力，并與其巰基形成氫鍵[93]。第二步，位置2處帶正電的基團催化離去基團的離去，速度較快[100]。對GSH和底物之間的催化反應一般是依序形成酶-GSH-親電子底物三元復合物，GSTsC-末端對于活性不是必需的[100]。圖1-4GSTs的催化機制Fig1-4CatalyticmechanismofGSTs研究發(fā)現(xiàn)藥用野生稻的GST基因對抵御低溫脅迫、稻瘟病菌，重金屬、干旱和高鹽等有重要作用，小麥中的GSTF6基因可增強植株的干旱抗性，擬南芥GST家族中多個GST受到SA和真菌激發(fā)，幾丁質被誘導表達，說明這些基因可能參與了植物的抗病響應[92]。不同種類的GST，位于氨基酸殘端的G位點的功能以及形成的H位點均不同。由于H位點結構影響GST底物的特性，使得GST超家族能催化許多不同結構化合物反應[92]，研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)GST催化花青素與GSH結合，然后在轉運酶的作用下轉運到液泡中或者排除體外，從而降低花青素對自身的毒害[101]。劉海峰、王軍等通過克隆山葡萄中的谷胱甘肽S-轉移酶基因(VAmGST4)，并通過半定量表達分析該基因的表達與花色苷的生物合成密切相關[102]。植物GSTs的“原始”功能很差，因為GSH結合的內(nèi)源性植物底
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