壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis）是十字花科碎米薺屬多年生草本植物,屬于超聚硒植物。硒是人和動(dòng)物的必需微量元素,因此可以通過(guò)從高聚硒植物中獲取對(duì)人類(lèi)有益的有機(jī)硒來(lái)補(bǔ)硒,而探索壺瓶碎米薺體內(nèi)的硒代謝機(jī)制成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)80mg·mL^-1的硒處理壺瓶碎米薺,其葉內(nèi)GST-u4基因表達(dá)量顯著增加,推測(cè)GST-u4基因與硒螯合作用及液泡貯存有關(guān)。本文采用RT-PCR方法克隆了ChGST-u4,利用在線工具對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;并對(duì)該基因密碼子優(yōu)化,構(gòu)建表達(dá)載體,熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌Arctic Express進(jìn)行表達(dá)條件篩選,得到的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后通過(guò)等溫滴定量熱法對(duì)其活性進(jìn)行了初步研究,為壺瓶碎米薺體內(nèi)硒的代謝機(jī)制研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ),主要研究結(jié)果如下:1、ChGST-u4確系谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因家族tau亞家族基因;分子量大小為672bp,該基因編碼224個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量25.6872kDa,丙氨酸的含量最豐富,占總量的4.9%;理論等電點(diǎn)為6.18,該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽,有9個(gè)磷酸化位點(diǎn);為親水蛋白;ChGST-u4的... 

【文章來(lái)源】：湖北民族大學(xué)湖北省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

壺瓶碎米薺Figure1-1.Cardaminehupingshanensis

第1章文獻(xiàn)綜述-7-65]，還可以利用改變泛素-蛋白酶途徑，修正蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，對(duì)異型蛋白水解，從而除去硒毒性，使得植物能耐受更高濃度的硒[57]。圖1-2植物硒代謝概要圖[25]Figure1-2.SchematicoverviewofSemetabolisminplants1.3.3硒在植物中的貯藏方式及形態(tài)硒最常見(jiàn)的價(jià)態(tài)有-2、0、2、4和6。硒對(duì)植物的主要有效形式是無(wú)機(jī)的，即亞硒酸鹽(SeIV）和硒酸鹽(SeVI)[64]。有機(jī)硒主要以硒蛋白、硒多糖及硒核酸為主，還有少量的硒代氨基酸及其衍生物，占總量的80%[66]。人類(lèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的植物種類(lèi)積累了許多含硒的代謝物：硒代甲硫氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(SeCys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMeSeCys)、硒代胱氨酸、谷氧�；谆腚装彼�、硒乙酰膽堿等等(如圖1-3)。但是植物內(nèi)最常見(jiàn)的是硒代甲硫氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(SeCys)和甲基硒代半胱氨酸(SeMeSeCys)。外源硒的形態(tài)和代謝方式?jīng)Q定了硒在植株體內(nèi)的形態(tài)、轉(zhuǎn)移和分布[67,68]。硒酸鹽進(jìn)入植物體內(nèi)立即傳遞到木質(zhì)部多以硒酸根的形式儲(chǔ)存，而亞硒酸鹽在根中迅速轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒化合物[40]。如西芹、燈籠草、蒲公英施加硒酸鹽后其體內(nèi)主要硒形態(tài)為硒酸根[69]。如小麥的根系吸收亞硒酸鈉后，大部分的硒積累在根部，主要是在根部代謝轉(zhuǎn)化為SeMet、SeOMet、MeSeCys等有機(jī)態(tài)，而籽粒中以SeMet居多，其次是硒甲基化半胱氨酸和少量的硒代半胱氨酸[45]。通過(guò)對(duì)香蔥施加硒酸鹽、亞硒酸鹽和有機(jī)硒硒代蛋氨酸檢測(cè)硒形態(tài)的分布得出，外源硒為硒酸鹽時(shí)，

第1章文獻(xiàn)綜述-12-三烯C4的生物合成、抗氧化等方面發(fā)揮重要作用。此外，由于GSTs的高水溶性、在細(xì)胞內(nèi)的豐富性和結(jié)合特性，GSTs參與了一系列結(jié)構(gòu)多樣的疏水性配體的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和儲(chǔ)存，如血紅素、膽紅素、激素、類(lèi)黃酮、脂肪酸和外源物質(zhì)[99]。GSTs的催化機(jī)制可分為三個(gè)步驟(如圖1-4)，即第一步GSH去質(zhì)子化，親和攻擊親電子底物，在位置1的廣義堿（Tyr6(μ)、Tyr7(π)或Tyr8(α)的-OH）能提高GSH與底物的親和能力，并與其巰基形成氫鍵[93]。第二步，位置2處帶正電的基團(tuán)催化離去基團(tuán)的離去，速度較快[100]。對(duì)GSH和底物之間的催化反應(yīng)一般是依序形成酶-GSH-親電子底物三元復(fù)合物，GSTsC-末端對(duì)于活性不是必需的[100]。圖1-4GSTs的催化機(jī)制Fig1-4CatalyticmechanismofGSTs研究發(fā)現(xiàn)藥用野生稻的GST基因?qū)Φ钟蜏孛{迫、稻瘟病菌，重金屬、干旱和高鹽等有重要作用，小麥中的GSTF6基因可增強(qiáng)植株的干旱抗性，擬南芥GST家族中多個(gè)GST受到SA和真菌激發(fā)，幾丁質(zhì)被誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明這些基因可能參與了植物的抗病響應(yīng)[92]。不同種類(lèi)的GST，位于氨基酸殘端的G位點(diǎn)的功能以及形成的H位點(diǎn)均不同。由于H位點(diǎn)結(jié)構(gòu)影響GST底物的特性，使得GST超家族能催化許多不同結(jié)構(gòu)化合物反應(yīng)[92]，研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)GST催化花青素與GSH結(jié)合，然后在轉(zhuǎn)運(yùn)酶的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中或者排除體外，從而降低花青素對(duì)自身的毒害[101]。劉海峰、王軍等通過(guò)克隆山葡萄中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(VAmGST4)，并通過(guò)半定量表達(dá)分析該基因的表達(dá)與花色苷的生物合成密切相關(guān)[102]。植物GSTs的“原始”功能很差，因?yàn)镚SH結(jié)合的內(nèi)源性植物底


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