離子通道（受體）（例如電壓門控通道、機械門控通道和配體門控通道等）在許多生物體內的生理活性中起著非常重要的作用。離子通道（受體）的功能異�；蛘吖δ苁С䦟е略S多疾病的發(fā)生,例如慢性疼痛、心臟或腦疾病、關節(jié)炎以及運動障礙等。天然多肽（2-50個氨基酸分子）可以作為調節(jié)分子與離子通道（受體）分子相互作用。對于活性多肽功能高通量的活性研究最重要的兩個限速步驟為:1)是否能夠快速的進行基因克隆操作,在較短的時間內構建大量的表達載體;2)該表達載體是否能夠獲得二硫鍵正確折疊的活性多肽。針對這兩個瓶頸,本論文首先建立了一種新的基因克隆方法——OEPR克隆,其最重要的特點就是OEPR克隆把基于重疊延伸PCR方法和基于同源重組的方法完美地結合到了一起。OEPR克隆通過在插入基因的上游引物和下游引物的5’端分別引入一段與載體插入位點同源的序列。上游引物5’端引入的同源序列為15-30個堿基,用于同源重組反應;下游引物5’端引入的同源序列的Tm值為68-70℃,用于重疊延伸PCR反應。通過兩步PCR反應之后,可以獲得一條線性的目的質粒,其兩端具有一段同源序列（15-30 bp）,可以幫助其在大腸桿菌體內被... 

【文章來源】：國防科技大學湖南省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數】：173 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

通過重疊延伸PCR進行剪切或者多位點點突變示意圖

上面一行表示正義鏈，下面一行表示反義鏈。在第一輪 PCR（圖）中，分別使用引物引物對 F1F 和 F1RT、F2FT 和 F2RT 以及 F3FT應的 DNA 片段獲得 DNA 擴增產物 F1、F2 和 F3。 F1 在 3’末端添（藍色），F2 在 5’末端（藍色）和 3’末端（綠色）添加了尾部序 5’端添加了尾部序列（綠色）。在第二輪 PCR（圖 1.1D）中，在CR 混合物中依次加入 F1、F2 和 F3，然后在一個反應管中使用引物增全長 DNA[2]。疊延伸 PCR 不依賴于任何的限制性酶切位點，任何兩個片段都可以自由拼接在一起�；谥丿B延伸 PCR 技術，多個 DNA 片段可以同一起，目前已獲得的最大拼接片段超過 20 kbp[3]。通過重疊延伸 P序列中引入突變、刪除和替換等[4,5]，全基因合成也可以通過重疊延若干個短的相互重疊的引物拼接成全長的基因序列[6,7]。重疊延伸 P行基因的剪切與引入多位點點突變的實驗[2,8]。1.2 基于定點突變的無縫連接克隆

IFPC克隆技術原理示意圖


本文編號：3365358