離子通道（受體）（例如電壓門控通道、機(jī)械門控通道和配體門控通道等）在許多生物體內(nèi)的生理活性中起著非常重要的作用。離子通道（受體）的功能異�；蛘吖δ苁С�(huì)導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生,例如慢性疼痛、心臟或腦疾病、關(guān)節(jié)炎以及運(yùn)動(dòng)障礙等。天然多肽（2-50個(gè)氨基酸分子）可以作為調(diào)節(jié)分子與離子通道（受體）分子相互作用。對(duì)于活性多肽功能高通量的活性研究最重要的兩個(gè)限速步驟為:1)是否能夠快速的進(jìn)行基因克隆操作,在較短的時(shí)間內(nèi)構(gòu)建大量的表達(dá)載體;2)該表達(dá)載體是否能夠獲得二硫鍵正確折疊的活性多肽。針對(duì)這兩個(gè)瓶頸,本論文首先建立了一種新的基因克隆方法——OEPR克隆,其最重要的特點(diǎn)就是OEPR克隆把基于重疊延伸PCR方法和基于同源重組的方法完美地結(jié)合到了一起。OEPR克隆通過在插入基因的上游引物和下游引物的5’端分別引入一段與載體插入位點(diǎn)同源的序列。上游引物5’端引入的同源序列為15-30個(gè)堿基,用于同源重組反應(yīng);下游引物5’端引入的同源序列的Tm值為68-70℃,用于重疊延伸PCR反應(yīng)。通過兩步PCR反應(yīng)之后,可以獲得一條線性的目的質(zhì)粒,其兩端具有一段同源序列（15-30 bp）,可以幫助其在大腸桿菌體內(nèi)被... 

【文章來源】：國防科技大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：173 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

通過重疊延伸PCR進(jìn)行剪切或者多位點(diǎn)點(diǎn)突變示意圖

上面一行表示正義鏈，下面一行表示反義鏈。在第一輪 PCR（圖）中，分別使用引物引物對(duì) F1F 和 F1RT、F2FT 和 F2RT 以及 F3FT應(yīng)的 DNA 片段獲得 DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物 F1、F2 和 F3。 F1 在 3’末端添（藍(lán)色），F(xiàn)2 在 5’末端（藍(lán)色）和 3’末端（綠色）添加了尾部序 5’端添加了尾部序列（綠色）。在第二輪 PCR（圖 1.1D）中，在CR 混合物中依次加入 F1、F2 和 F3，然后在一個(gè)反應(yīng)管中使用引物增全長(zhǎng) DNA[2]。疊延伸 PCR 不依賴于任何的限制性酶切位點(diǎn)，任何兩個(gè)片段都可以自由拼接在一起�；谥丿B延伸 PCR 技術(shù)，多個(gè) DNA 片段可以同一起，目前已獲得的最大拼接片段超過 20 kbp[3]。通過重疊延伸 P序列中引入突變、刪除和替換等[4,5]，全基因合成也可以通過重疊延若干個(gè)短的相互重疊的引物拼接成全長(zhǎng)的基因序列[6,7]。重疊延伸 P行基因的剪切與引入多位點(diǎn)點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)[2,8]。1.2 基于定點(diǎn)突變的無縫連接克隆

IFPC克隆技術(shù)原理示意圖


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