血友病B（Hemophilia B,HB）是X連鎖單基因缺陷疾病,由于FⅨ基因的突變導(dǎo)致凝血因子IX（Factor IX,FⅨ）的缺陷,或者生成無活性FⅨ。FⅨ是一種凝血因子,在發(fā)生凝血反應(yīng)時(shí),被活化的FⅨ可以將凝血酶原激活成為凝血酶發(fā)揮凝血功能。目前,臨床上使用藥物替代療法,將FⅨ蛋白直接注射到患者血液中,以維持體內(nèi)的凝血功能,但是這種治療手段成本高,治療時(shí)間長,需要持續(xù)用藥。干細(xì)胞移植是目前正在發(fā)展的有效治療手段,通過對患者體內(nèi)提取出來的干細(xì)胞進(jìn)行體外基因糾正,再回輸?shù)交颊唧w內(nèi),讓其在患者體內(nèi)表達(dá)活性FⅨ,從而達(dá)到治療效果。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell,MSC）也是干細(xì)胞來源,它遍布于人體每個(gè)器官組織,具有多向分化潛能,是細(xì)胞治療的良好細(xì)胞載體,因此本研究使用人源MSC作為治療細(xì)胞,探究LV-FⅨ在MSC中的表達(dá)情況。本研究首先構(gòu)建LV-EF1α-FⅨ,用于探究MSC表達(dá)外源FⅨ的情況。表達(dá)檢測結(jié)果表示,啟動子EF1α可以在兩種人源MSCs（FT902和1207-9）中高效啟動表達(dá)FⅨ,并分泌到胞外表現(xiàn)出一定的凝血功能。FⅨ的蛋白修飾檢測表明,由MSC表... 

【文章來源】：電子科技大學(xué)四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

凝血機(jī)制圖

第一章緒論5可以應(yīng)用于絕大多數(shù)的基因缺陷疾玻常用的治療策略見圖1-3。圖1-3慢病毒介導(dǎo)基因治療策略1.5MSC的介紹及其相關(guān)應(yīng)用MSC是一種非造血干細(xì)胞，具有高度自我復(fù)制的能力和多重分化潛能[19]。多分布于各個(gè)組織和器官中。目前已有多個(gè)組織被證實(shí)可以提取出MSC：骨髓[20]、臍帶血[21]、羊膜囊[22]、胎盤[23]、牙組織[24]。不同來源的MSC生物性質(zhì)有所差異，但也有類似的生物性質(zhì)用于區(qū)分定義，比如MSC表面抗原，陽性：CD73+、CD90+、CD105+；陰性:CD34-、CD45-、CD11b-；其次，MSC具有分化成軟骨、脂肪和成骨的能力，也是定義MSC的標(biāo)準(zhǔn)之一。MSC本身具有免疫調(diào)節(jié)的特性和組織修復(fù)的能力，免疫調(diào)節(jié)功能[25]和組織修復(fù)功能，早期臨床實(shí)驗(yàn)使用MSC來治療移植物抗宿主病（GVHD），可以有效調(diào)節(jié)移植物在宿主體內(nèi)的免疫排斥[26]。在血友病領(lǐng)域，MSC作為治療基因的載體，應(yīng)用相對較少。到目前為止，已有文獻(xiàn)使用不同組織來源的MSC在體外進(jìn)行外源FIX的表達(dá)：骨髓[20]、脂肪[27]、臍帶血[28]。在動物模型中，干細(xì)胞移植更偏向于使用HSC，因?yàn)镠SC是血液系統(tǒng)的細(xì)胞，具有良好的血液相容性，通過靜脈注射到血管中的HSC可以長時(shí)間存在于血液中分化增殖。而MSC屬于組織干細(xì)胞，血液相容性差，通過靜脈移

第三章LV-EF1α-FIX在MSC中的表達(dá)25圖3-1LV-EF1α-FIX的VCN通過對LV-EF1α-FIX進(jìn)行病毒Titer的檢測，結(jié)果表明病毒Titer可以高達(dá)3×109~4×109，說明在1mL的病毒液中，具有活性的病毒數(shù)量為3×109~4×109，驗(yàn)證了慢病毒包裝系統(tǒng)效率高，完全具備應(yīng)用于基因治療研究的能力。3.2.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞VCN檢測FT902和1207-9兩種人源MSC細(xì)胞系分別來源于胚胎胸腺組織和胚胎足部組織。通過人源端粒酶基因（HumanTelomeraseReverseTranscriptase,hTERT）的轉(zhuǎn)染使其具備永生化的特性，形成MSC細(xì)胞系。經(jīng)過LV-EF1α-FIX的轉(zhuǎn)染，方法如2.4.3.1.所示，我們在轉(zhuǎn)染后第七天左右收集約1×106細(xì)胞進(jìn)行DNA的提取和VCN的檢測，方法如2.3.4所示。結(jié)果如圖3-2所示。圖3-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞VCN檢測VCN結(jié)果表示，兩種MSCs在經(jīng)過LV-EF1α-FIX轉(zhuǎn)染后，VCN可以穩(wěn)定在100%~200%，即平均一個(gè)細(xì)胞中具備1個(gè)至2個(gè)病毒拷貝數(shù)，符合我們的預(yù)期。因?yàn)樵跍y試中發(fā)現(xiàn)高VCN的細(xì)胞狀態(tài)不好。


本文編號：3360476