目的:利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Toll樣受體4（TLR4）基因敲除小鼠模型,并觀察突變小鼠對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖（LPS）刺激響應(yīng)的變化。方法:針對(duì)TLR4基因外顯子2設(shè)計(jì)并合成1對(duì)sgRNA片段,與編碼Cas9的mRNA混合后通過(guò)受精卵顯微注射方法,建立TLR4基因敲除小鼠,通過(guò)繁育獲得基因敲除純合子小鼠（TLR4-/-小鼠）;通過(guò)LPS刺激,分析TLR4-/-小鼠對(duì)炎癥應(yīng)激的反應(yīng)情況,并在分子和病理水平上和野生型對(duì)照（WT）進(jìn)行比較。結(jié)果:PCR及測(cè)序檢測(cè)表明TLR4基因外顯子2在小鼠基因中被成功敲除;給予LPS刺激后,IL1β、IL6、My D88、i NOS及TNFa等炎癥因子的表達(dá)在野生型小鼠的心、肝和肺組織中顯著上調(diào),而在TLR4-/-小鼠中則幾乎沒(méi)有變化;血生化指標(biāo)顯示LPS刺激后WT小鼠血清中的尿素（Urea）和肌酐（Cre）水平顯著升高,而TLR4-/-小鼠刺激前后無(wú)顯著變化,病理分析同樣發(fā)現(xiàn)TLR4-/-小鼠能夠抵抗LPS對(duì)腎組織的損傷。結(jié)論:利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了TLR4基因剔除小鼠模型,TLR4的缺失能夠降低IL1β、IL6、My D... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)生物工程雜志. 2020,40(06)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

TLR4-/-小鼠基因敲除策略

TLR4基因敲除小鼠基因型鑒定結(jié)果

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了LPS刺激前后TLR4及下游基因在小鼠各組織中mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖3顯示，將PCR引物設(shè)計(jì)在敲除的外顯子2區(qū)域內(nèi)，在野生型小鼠中可以檢測(cè)到明顯的TLR4信號(hào)，并能檢測(cè)到LPS刺激后的顯著上調(diào)，但在LPS刺激前后TLR4-/-小鼠的組織中未能夠檢測(cè)到TLR4基因的信號(hào)，說(shuō)明在mRNA水平實(shí)現(xiàn)了對(duì)TLR4基因目的片段的敲除;對(duì)LPS刺激后，TLR4-/-小鼠的心、肝、肺組織中TLR4參與調(diào)節(jié)的IL1β、IL6、My D88、i NOS及TNFa等下游響應(yīng)基因的表達(dá)均顯著低于同窩野生型，尤其是IL6的表達(dá)在LPS刺激后的TLR4-/-小鼠中幾乎檢測(cè)不到。采用Western blot和ELISA進(jìn)一步對(duì)TLR4下游基因i NOS、TNF-α和IL-6的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。LPS刺激前WT和TLR4-/-小鼠的肝臟組織均未有i NOS陽(yáng)性條帶顯示，LPS刺激后僅有WT小鼠中檢測(cè)到i NOS表達(dá)的陽(yáng)性條帶(圖4a)。血清中TNF-α和IL-6的檢測(cè)數(shù)據(jù)如圖4b所示，LPS刺激前WT和TLR4-/-小鼠的血清中均未檢測(cè)出TNF-α和IL-6,LPS刺激后WT小鼠血清中TNF-α和IL-6表達(dá)顯著上調(diào)，分別達(dá)到168.759±39.285pg/ml和675.630±133.246ng/ml，但依然無(wú)法在TLR4-/-小鼠的血清中檢測(cè)到兩者的表達(dá)。圖4 LPS刺激前后TLR4-/-小鼠i NOS,TNF-α和IL-6表達(dá)檢測(cè)


本文編號(hào)：3360417