發(fā)布時(shí)間：2021-08-06 05:28

　　超氧化物歧化酶（SOD EC 1.15.1.1）是一種抗氧化金屬酶,通過(guò)催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng),產(chǎn)生過(guò)氧化氫和氧氣,有效抵御氧化壓力和氧化損傷。本論文對(duì)來(lái)自Acidothermus cellulolyticus 11B中超氧化物歧化酶（AcSOD）進(jìn)行提取、純化;并利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆了AcSOD基因,構(gòu)建了不同的表達(dá)載體,表達(dá)并純化了重組蛋白,表征了酶學(xué)性質(zhì),探討了該酶的催化類型。通過(guò)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),AcSOD和已知的Ni-SOD有高度的序列保守性,鎳鉤（Ni-hook）的9個(gè)殘基（His-Cys-X-X-Pro-Cys-Gly-X-Tyr）可能是鎳型超氧化物歧化酶的關(guān)鍵判斷。同源模建結(jié)果表明AcSOD與PDB號(hào)為3G50的Ni-SOD序列相似性達(dá)到68.38%。暗示該酶可能是一種新型的Ni-SOD。為了闡明該酶的催化機(jī)制,本論文首先應(yīng)用硫酸銨沉淀和陰離子交換層析方法從原始菌株中將該酶純化了331倍,比活力達(dá)到2450 U/mg。但是純化的酶的純度未達(dá)到進(jìn)一步分析的要求。本論文應(yīng)用分子生物學(xué)的方法克隆了AcSOD基因的完整閱讀框,進(jìn)一步構(gòu)建了三種表達(dá)載體（pET28a-SOD1... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

AcSODBLAST比對(duì)結(jié)果

第二章Acidothermuscellulolyticus11B超氧化物歧化酶的序列分析、模建與純化14圖2.3超氧化物歧化酶酶活位點(diǎn)保守堿基比對(duì)分析（1）Prochlorococcusmarinusstr.MIT9313，（2）Synechococcussp.WH8102，（3）ProchlorococcusmarinusMED4，（4）TrichodesmiumerythraeumIMS101，（5）StreptomycesaVermitilisMA-4680有助于Ni-hook或其穩(wěn)定化的保守殘基以綠色顯示。保守的靜電殘基顯示為藍(lán)色，其他保守殘基顯示為紅色。2.3.2超氧化物歧化酶同源模建選取已經(jīng)解析蛋白結(jié)構(gòu)、與其同源性相近的來(lái)源于Streptomycescoelicolor（PDBID：3G50）的鎳型超氧化物歧化酶蛋白結(jié)構(gòu)作為模板，輸入PDB號(hào)后結(jié)果顯示預(yù)測(cè)本論文中研究的酶有3個(gè)亞基，選取其中一個(gè)亞基進(jìn)行同源模建，如圖2.4左圖為來(lái)源于S.coelicolor的單亞基結(jié)構(gòu)，帶有金屬結(jié)合鉤，其中黑色實(shí)心球表示結(jié)合的金屬鎳離子；右圖為預(yù)測(cè)的AcSOD單亞基結(jié)構(gòu)。此外，如圖2.5左圖表示來(lái)源于S.coelicolorNi-SOD蛋白結(jié)構(gòu)是由4螺旋束（標(biāo)記為AF）的六聚體組裝體，有三個(gè)亞基（A，B和C；D，E和F）。右圖是把三個(gè)亞基組裝在一起形成的預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)圖。圖2.6為SWISS-MODEL結(jié)果顯示圖，GMQE全局模型質(zhì)量評(píng)估區(qū)間為0-1，AcSOD顯示為0.9，說(shuō)明用該校準(zhǔn)與模板構(gòu)建的模型的預(yù)期精度比較高，質(zhì)量高。QMEAN評(píng)估區(qū)間-4-0，AcSOD的QMEAN為0.5，接近0，說(shuō)明AcSOD與模板蛋白的匹配度好。通過(guò)此圖可以發(fā)現(xiàn)AcSOD與來(lái)源于S.coelicolor的Ni-SOD序列相似性達(dá)到68.38%，相似度很高，暗示該

第二章Acidothermuscellulolyticus11B超氧化物歧化酶的序列分析、模建與純化15酶可能是一種新型的Ni-SOD。圖2.4左圖為PDBID：3G50Ni-SOD單亞基結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)的AcSOD單亞基結(jié)構(gòu)圖2.5左圖為PDBID：3G50的Ni-SOD蛋白結(jié)構(gòu)和右圖預(yù)測(cè)的AcSOD結(jié)構(gòu)圖2.6SWISS-MODEL結(jié)果顯示圖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[2]兔血超氧化物歧化酶的提取及其在酸奶中的應(yīng)用[D]. 曾麗.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]豬血超氧化物歧化酶的提取、性質(zhì)及其化學(xué)修飾研究[D]. 劉婧.吉林大學(xué) 2011
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