犬細(xì)小病毒病是一種由犬細(xì)小病毒（Canine Parvovirus virus,CPV）引起的犬類動(dòng)物的高度接觸性傳染性疾病。犬細(xì)小病毒病從發(fā)現(xiàn)至今一直在我國(guó)不同省市地區(qū)廣泛流行,給我國(guó)的養(yǎng)犬業(yè)和寵物業(yè)造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失。一直以來(lái)接種疫苗是控制CPV流行的關(guān)鍵,但隨著毒株的不斷變異,對(duì)CPV的防控更加困難,因此研制安全高效的CPV疫苗對(duì)預(yù)防我國(guó)犬細(xì)小病毒病的流行具有重大的意義。本研究首先通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了CPV主要抗原VP2基因片段,經(jīng)過(guò)酶切鑒定和測(cè)序分析,確定所得VP2片段無(wú)堿基缺失或插入,將VP2片段克隆至本實(shí)驗(yàn)室建立的桿狀病毒多基因表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行CPV-VP2蛋白的表達(dá),同時(shí)為了優(yōu)化VP2蛋白的表達(dá)量構(gòu)建了一系列重組桿狀病毒p YBDM-IM-polh-VP2、p YBDM-IM-p10-VP2和p YBDM-IM-polh-VP2-p10-VP2。重組病毒攜帶的m Cherry紅色熒光蛋白基因,將重組病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞后可以在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光。收集細(xì)胞的培養(yǎng)液上清進(jìn)行基因組DNA的提取,根據(jù)VP2的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示成功擴(kuò)增出1750 bp左... 

【文章來(lái)源】：南陽(yáng)師范學(xué)院河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 綜述
    1.1 病原
        1.1.1 CPV生物學(xué)特性
        1.1.2 CPV基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.3 主要蛋白VP2結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.4 CPV的起源和進(jìn)化
    1.2 CPV致病機(jī)理與流行病學(xué)
        1.2.1 CPV致病機(jī)理
        1.2.2 CPV流行病學(xué)
    1.3 CPV的診斷和預(yù)防
        1.3.1 CPV的診斷
        1.3.2 CPV的預(yù)防
    1.4 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為表達(dá)工具的基因工程疫苗的發(fā)展
2 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞、小白鼠
        2.1.2 相關(guān)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)室常用試劑配制
        2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)基的配制
        2.2.2 昆蟲細(xì)胞Grace培養(yǎng)基的配制
        2.2.3 抗生素配制與相關(guān)試劑
        2.2.4 核酸電泳相關(guān)試劑配制方法
        2.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑
        2.2.6 蛋白免疫印跡所需試劑
        2.2.7 蛋白純化試劑
    2.3 分子生物學(xué)基本操作
        2.3.1 質(zhì)粒的提取
        2.3.2 瓊脂糖凝膠電泳和回收
        2.3.3 PCR溶液回收
        2.3.4 感受態(tài)細(xì)胞制備方法
        2.3.5 大腸桿菌Top10轉(zhuǎn)化
        2.3.6 菌種的保存
    2.4 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基本操作
        2.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.4.2 細(xì)胞傳代
        2.4.3 細(xì)胞凍存
        2.4.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)
    2.5 CPVVP2基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)
        2.5.1 桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.5.2 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
    2.6 重組桿狀病毒的構(gòu)建
        2.6.1 Tn7轉(zhuǎn)座
        2.6.2 侵染蛋白介導(dǎo)的經(jīng)濟(jì)高效生產(chǎn)感染性重組病毒粒子
        2.6.3 重組Bacmid菌液感染昆蟲細(xì)胞
    2.7 重組病毒鑒定和滴度的測(cè)定
        2.7.1 提取病毒基因組
        2.7.2 制作病毒q-PCR曲線測(cè)定滴度
        2.7.3 終點(diǎn)稀釋法測(cè)病毒滴度
    2.8 蛋白表達(dá)檢測(cè)
        2.8.1 裂解細(xì)胞
        2.8.2 樣品處理
        2.8.3 SDS-PAGE電泳
        2.8.4 WesternBlot檢測(cè)蛋白表達(dá)
    2.9 表達(dá)蛋白的純化和濃度測(cè)定
        2.9.1 蛋白純化
        2.9.2 標(biāo)簽ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度
    2.10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
        2.10.1 動(dòng)物分組
        2.10.2 抗原的制備
        2.10.3 疫苗注射
        2.10.4 免疫效果檢測(cè)
3 結(jié)果與分析
    3.1 CPVVP2基因的擴(kuò)增和T載體克隆
        3.1.1 19T-VP2菌液PCR鑒定
        3.1.2 19T-VP2酶切鑒定
    3.2 VP2基因測(cè)序
    3.3 重組轉(zhuǎn)移載體酶切鑒定
        3.3.1 轉(zhuǎn)移載體pYBDM-IM-p10VP
        3.3.2 轉(zhuǎn)移載體pYBDM-IM-phVP
        3.3.3 轉(zhuǎn)移載體pYBDM-IM-p10VP2-phPV
    3.4 重組Bacmid菌液PCR鑒定
    3.5 重組桿狀病毒基因組DNA的PCR驗(yàn)證
    3.6 細(xì)胞熒光和病毒滴度
        3.6.1 細(xì)胞熒光檢測(cè)
        3.6.2 終點(diǎn)稀釋法測(cè)定重組病毒滴度
        3.6.3 制作q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定病毒滴度
    3.7 CPVVP2蛋白檢測(cè)
        3.7.1 CPVVP2蛋白小量表達(dá)SDS-PAGE檢測(cè)
        3.7.2 CPVVP2蛋白WesternBlot檢測(cè)
        3.7.3 His標(biāo)簽ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白含量
    3.8 CPVVP2蛋白純化
        3.8.1 CPVVP2蛋白純化結(jié)果
        3.8.2 純化蛋白的WesternBlot鑒定
    3.9 CPVVP2蛋白免疫原性檢測(cè)結(jié)果
4 討論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]犬細(xì)小病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 張玉香,李改茹,紀(jì)森林,檀濟(jì)敏,王茹怡,粟碩.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(12)
[3]犬細(xì)小病毒病毒樣顆粒的研究進(jìn)展[J]. 陳進(jìn)會(huì),劉國(guó)慶,顏其貴,陳珍容.  檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊. 2016(04)
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[6]昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展及其在疫苗中的應(yīng)用[J]. 梁璐琪.  畜禽業(yè). 2014(10)
[7]犬細(xì)小病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立和臨床應(yīng)用[J]. 李濤,王高玲,王斌,修金生,胡崇偉,馬金友.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2014(11)
[8]桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在獸用亞單位疫苗領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 劉春菊,任煒杰,王志亮.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2013(09)
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博士論文
[1]優(yōu)化桿狀病毒系統(tǒng)作為動(dòng)物疫苗載體的研究[D]. 劉陽(yáng)坤.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3325248