石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬的多年生落葉喬木或灌木,是一種既有營養(yǎng)價值又有觀賞價值的特色果樹。石榴花為兩性花,根據(jù)雌蕊發(fā)育程度的不同分為完全花和不完全花。完全花即筒狀花,發(fā)育良好坐果率高;不完全花即鐘狀花發(fā)育不正常、易脫落,直接影響了石榴筒狀花與鐘狀花的比例以及石榴的產(chǎn)量。有關(guān)研究表明赤霉素是石榴筒狀花和鐘狀花形成的重要影響因素,因此本試驗以‘紅玉石籽’石榴為試驗材料,測定石榴筒狀花和鐘狀花的外形指標與赤霉素含量;克隆石榴赤霉素生物合成途徑關(guān)鍵基因（PgKO、PgGA20ox）并分析它們在筒狀花和鐘狀花中的表達特性;同時構(gòu)建PgKO過表達載體,通過花序浸染法獲得轉(zhuǎn)PgKO基因擬南芥株系,對T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥進行熒光定量試驗。試驗所得結(jié)果如下:1、克隆得到赤霉素生物合成關(guān)鍵基因PgKO和PgGA2ox的cDNA全長序列。PgKO（登錄號:MG208017）全長序列為1729bp,開放閱讀框有1542個堿基,非編碼區(qū)有186個堿基,編碼513個氨基酸。GA20ox（登錄號:MH104888）全長序列為1676 bp,開放閱讀框有993個堿基,非編碼區(qū)有683個... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖４－１石榴鐘狀花和筒狀花的外形對比圖??

４．２赤霉素在石榴不同花型中的含置分析??測得石榴筒狀花和鐘狀花中的赤霉素含量如（圖４－３）所示，筒狀花中花柱??的赤霉毒含量最高為５．８３?ｐｇ／ｇ，其次是子房、萼筒、花萼、花瓣，花藥的赤霉素??含量最低為２．８９?ｆｉｇ／ｇ，鐘狀花中子房的赤霉毒含量最高為４．３２?噸／ｇ，其次是花??柱、萼筒、花萼、花瓣，花藥的赤霉素含量最低為２．４５?ｐｇ／ｇ，筒狀花不同器官部??位的赤霉素含量都高于鐘狀花，其中子房、花瓣、萼筒、花柱之間的赤霉素含量??呈現(xiàn)出顯著性差異，花萼與花藥之間的含量呈現(xiàn)出不顯著性差異。??＂Ｉ?？蒔狀花?口鐘狀花??ｗ?ｃｙｌｉｎｄｒｉｃ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ?ｔｒｕｍｐｅｔ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ??ｌｌｌｌ?ｌｉ?ｌｌ?１１?ｉｉ?ｌｌ??３?Ｏ????１???１?■■??１?ＩＨ??１???１?■■??１??子房?花瓣?花萼?萼簡?花藥?花柱??ｏｖａｒｙ?ｐｅｔａｌ?ｃａｌｙｘ?ｃａｌｙｘ?ｔｕｂｅ?ａｎｔｈｅｒ?ｓｔｙｌｅ??圖４－３石榴鐘狀花和筒狀花赤霉素含量??Ｆｉｇ．４－３?Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ?ｃｏｎｔｅｎｔ?ｉｎ?ｃｙｌｉｎｄｒｉｃ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ?ａｎｄ?ｔｒｕｍｐｅｔ－ｓｈａｐｅｄ?Ｈｏｗｅｒｓ?ｏｆ?ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ??４．?３石榴花中總ＲＮＡ的提取及檢測??參照ＲＮＡ提取試劑盒的操作流程，提取石榴花中的總ＲＮＡ，并將產(chǎn)物進行??電泳檢測，結(jié)果如圖４－４所示，提取的總ＲＮＡ條帶完整，無拖帶，均不含蛋白、??ＤＮＡ和酚類等雜質(zhì)物，條帶清晰明亮，通過核酸測定儀測定０Ｄ值為１．９２，表??明所提ＲＮＡ純度高，可用于后續(xù)實驗。??

１?Ｍ?２??２００Ｄｂｐ??ｌｏｏｏｂｐ??７５０ｂｐ??５００ｂｐ??２５０ｂｐ??ｌＯＤｂｐ??圖４－４石榴花中總ＲＮＡ的提取??Ｆｉｇ．４－４?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ?ｆｌｏｗｅｒｓ??４．?４石榴赤霉素生物合成途徑中關(guān)鍵基因的克隆??４．４．１?基因的克隆及生物信息學(xué)分析??４．４．１．１作奶基因的克隆??根據(jù)ＮＣＢ丨中己登入的其他物種幻９基因的保守序列，設(shè)計內(nèi)圍兼并引物??尺０－Ｆ２／尤Ｏ－Ｒｌ進行第一輪ＰＣＲ，之后以此產(chǎn)物為模板用外圍兼并引物??人Ｙ）－Ｆｌ／ＫＯ－Ｒ２進行第二輪ＰＣＲ，擴增得到長度為２６８?ｂｐ核酸片段（圖４－５，?Ａ），??用膠回收試劑盒對條帶進行膠回收，連接載體轉(zhuǎn)大腸桿菌，將培養(yǎng)菌液送至生物??公司進行測序。序列比對后，確定該擴增得到的是ＰｇＡ：０基因序列。在獲取的中??間片斷基礎(chǔ)上，繼續(xù)設(shè)計引物火０－５’０５？丨／１０）－５＇０５？２，按照５＼＾１＾＾？１＾八０￡??ｃＤＮＡ?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?Ｋｉｔ?（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）操作步驟，采用巢式ＰＣＲ法，以內(nèi)圍引物和??ＵＰＭ?Ｌｏｎｇ引物進行第一輪ＰＣＲ擴增，再以產(chǎn)物為模板，使用外圍引物和ＮＵＰ??引物進行第二輪ＰＣＲ擴增。用膠回收試劑盒對長度正確的條帶進行膠回收，并??連接轉(zhuǎn)化，挑�。校茫覚z測有條帶的陽性菌液送至生物公司測序，最后得到長度??為７９２?ｂｐ的目的片段（圖４－５，Ｂ），在ＮＣＢＩ中進行ＢＬＡＳＴ，確定該擴增得到的??是尸＃０的５＇端序列。??根據(jù)克隆得到的的中間片斷，使用Ｐｒｉｍｅｒ?５．０軟件設(shè)計引物??Ａ：０－３＇ＧＳＰｌ／／：ａ３＇ＧＳＰ２，同樣采用巢式ＰＣＲ法，

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]丹參赤霉素合成與代謝相關(guān)基因家族的鑒定、分子克隆及表達分析[D]. 杜清.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 2015
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本文編號：3314364