CRISPR/Cas9基因編輯技術已經(jīng)成功應用于多種植物基因組的編輯,但是在生菜中鮮有報道。本研究擬在生菜（Lactuca sati va L.）中建立CRISPR/Cas9基因編輯體系。首先根據(jù)生菜FANCM基因序列設計靶位點,構建Lsfancm-CRISPR/Cas9載體。然后以生菜子葉作為外植體,通過農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、愈傷組織誘導、芽再生及生根培養(yǎng)等過程,對生菜進行農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化,共獲得24株T₀代轉基因陽性植株。進一步對靶位點序列進行PCR并測序分析,發(fā)現(xiàn)4株轉基因生菜的靶位點發(fā)生基因編輯,產(chǎn)生fancm雜合突變體,并且在T₁代植株中鑒定到純合突變體。以上結果表明,本研究已成功將CRISPR/Cas9基因編輯體系有效地運用于生菜中,該體系的建立可為將來生菜的基因功能研究及分子育種提供重要的技術參考。 

【文章來源】：植物生理學報. 2017,53(04)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

pHSN401載體結構示意圖

738植物生理學報圖2CRIPSR/Cas9系統(tǒng)基因組編輯原理圖Fig.2TheschematicdiagramofgenomeeditingusingCRIPSR/Cas9system洗3次,最后轉移到1/2MS(MS鹽2.37g·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂7.5g·L-1,pH5.8)培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為22~24°C,16h光照,光照強度約100μmol·m-2·s-1。2.2.2外植體準備種子萌發(fā)5~6d后,將長度約5~7mm的子葉外植體從幼苗上切下。2.2.3農(nóng)桿菌侵染將pSoup質粒轉化根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài),然后將Lsfancm-CRIPSR/Cas9載體轉化GV3101/pSoup感受態(tài),以BsaI-T-F和BsaI-T-R為引物(表1)進行菌落PCR,挑選陽性單克隆菌落,接種在含有50μg·mL-1卡那霉素、50μg·mL-1利福平、25μg·mL-1慶大霉素、5μg·mL-1四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中,搖菌培養(yǎng)(220r·min-1,28°C)約12h至OD600=0.6~0.8。從上述菌液中取200μL稀釋于20mL添加相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,在220r·min-1,28°C條件下?lián)u菌10~12h至OD600=0.6~0.8。將菌液在1600×g,7°C條件下離心5min,用MS0(MS4.74g·L-1+蔗糖30g·L-1,pH5.8)重懸浮菌體,調整OD600=0.6~0.8。最后將外植體在菌液中浸泡10min。2.2.4共培養(yǎng)將在農(nóng)桿菌中浸泡過的外植體轉移至MS1[MS鹽4.74g·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂7.5g·L-1+激動素(kinetin,KT)1.0mg·L-1+吲哚乙酸(indoleaceticacid,IAA)0.2mg·L-1,pH5.8]培養(yǎng)基,使其背部接觸培養(yǎng)基。將外植體在黑暗條件下25°C共培養(yǎng)2d。2.2.5愈傷組織誘導及芽再生經(jīng)過2d的共培養(yǎng),將外植體轉移至MS2(MS1培養(yǎng)基+hyg17.0mg·L-1+特美汀300mg·L-1,pH5.8)培養(yǎng)基,使其背部接觸到培養(yǎng)基,在100μmol·m-2·s-1的光照強度,25°C條件下培養(yǎng)。每隔20d將外植體轉移至新的

禹明森等:生菜CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立739圖3Lsfancm-CRIPSR/Cas9載體構建流程圖Fig.3TheflowchartofLsfancm-CRIPSR/Cas9vectorconstructionU6-26t:擬南芥U6終止子;U6-29p:擬南芥U6啟動子;BsaI-T-F/R:靶位點正/反向引物;BsaI-T:融合BsaI酶切位點的靶序列。時,將它小心切下轉移至MS3(1/2MS培養(yǎng)基+IAA0.1mg·L-1,pH5.8)培養(yǎng)基上誘導生根。2.2.7馴化和移栽將幼苗移栽到營養(yǎng)土上(蛭石:營養(yǎng)土:珍珠巖=9:3:1),置于育苗盒內保濕培養(yǎng),光照培養(yǎng)并且逐步減低濕度至室內正常濕度(培養(yǎng)溫度22~24°C,光照時間12h,光照強度約200μmol·m-2·s-1)。等到幼苗馴化2~3周后,放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長。在幼苗以及生長時期,設定光照培養(yǎng)箱的條件為光照時間8h,溫度20°C;黑暗時間16h,溫度15°C。誘導開花時期,設定光照培養(yǎng)箱的條件為光照時間14h,溫度30°C;黑暗時間10h,溫度25°C。2.3轉基因植株鑒定2.3.1轉基因植株潮霉素抗性基因PCR鑒定本研究采用TaKaRaMiniBESTPlantGenomicDNAExtractionKit試劑盒提取生菜的基因組DNA,然后以潮霉素抗性基因引物HptII-F和HptII-R為鑒定引物(表1)對轉基因植株DNA進行PCR擴增:94°C預變性5min;94°C變性30s,60°C退火30s,72°C延伸50s,35個循環(huán)后;72°C再延伸10min。2.3.2轉基因陽性植株測序以引物Lsfancm-CRISPRseq-T-F和Lsfancm-CRISPRseq-T-R作為測序鑒定引物(表1)對轉基因陽性植株進行PCR擴增(94°C預變性3min;94°C變性15s,55°C退火15s,72°C延伸1min,35個循環(huán)后;72°C再延伸10min)并且測序。本研究的引物合成以及測序服務由上海睿迪生物技術有限公司完成。2.3.3生菜基因靶位點序列分析根據(jù)測序的峰型圖以及堿基序列來確定生菜的基因靶位點是否發(fā)生編輯。根據(jù)PCR產(chǎn)物測序峰型圖

【參考文獻】：
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