甘露聚糖酶通過對甘露聚糖類物質(zhì)的降解,可有效地提高飼料的營養(yǎng)利用率。本研究根據(jù)GenBank上黑曲霉（Aspergillu niger）CBS 513.88基因序列,通過畢赤酵母偏好性優(yōu)化β-甘露聚糖酶基因,人工合成全基因MANsyn,并連接至畢赤酵母表達(dá)載體pAO815,構(gòu)建β-甘露聚糖酶重組表達(dá)質(zhì)粒pAO815-MANsyn,之后成功電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中表達(dá),獲得一株酶活最高的菌株,其最適反應(yīng)溫度為70℃,最適pH為5.0,最大酶活能達(dá)到450 U/mL。反應(yīng)體系中加入終濃度為5 mM/L的Mg²⁺能使該β-甘露聚糖酶的酶活大幅提高126%。隨后,本研究成功利用同尾酶法構(gòu)建了β-甘露聚糖酶二拷貝、三拷貝、四拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒,并成功電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中表達(dá),二拷貝的酵母菌株酶活能達(dá)到539 U/mL,較單拷貝酵母菌株提高了20%,三拷貝的酵母菌株酶活能達(dá)到605U/mL,較單拷貝酵母菌株提高了34%,四拷貝的酵母菌株酶活能達(dá)到710 U/mL,較單拷貝酵母菌株提高了58%。本研究進(jìn)一步設(shè)計了β-甘露聚糖酶單點突變基因,并連接至赤酵母表達(dá)載體pAO815上,電... 

【文章來源】：武漢輕工大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

β-甘露聚糖酶的作用方式

轉(zhuǎn)錄可以形成包含相同拷貝數(shù)的較長的 mRNA，并且翻譯基因的多個同時翻譯可以增加目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)。由于小片段所構(gòu)太長，因此不會對宿主細(xì)胞造成太大的負(fù)擔(dān)，因此常常將感興趣應(yīng)用于小片段[39]。Gittins 等[40]研究了紅色熒光蛋白(amilFP597)瑚礁基因拷貝數(shù)的關(guān)系。結(jié)果表明，增加 amilFP597 基因的拷貝瑚顏色的動態(tài)范圍擴(kuò)大，并完成進(jìn)一步的實驗證實。這一結(jié)果是 amilFP597 的轉(zhuǎn)錄水平來實現(xiàn)的。

圖 1-3 表達(dá)盒的多拷貝表達(dá)載體Fig.1-3 Multiple-copy of expression cassette in an expression v動子的多拷貝因的多個拷貝和多個表達(dá)盒的拷貝不同，啟動子多拷達(dá)的新方法。該方法是在表達(dá)載體中將多個相同的啟的表達(dá)量提高(如圖 1-3)。雖然很多研究已經(jīng)證明該方法的原理機(jī)制尚不明確。Li 等[43]利用 Gibson[44]方法動子在熒光蛋白基因的上游，實驗結(jié)果表明，熒光蛋動子拷貝數(shù)成正比。Kanamasa 等[45]將 12 個 region Ⅲ表達(dá)載體上，用于增強(qiáng) β-甘露聚糖酶在棘孢曲霉中的重組菌株表達(dá)量比單拷貝的重組菌株表達(dá)量提高了 9克服了長靶基因的問題。 在實驗中，我們只需要連源蛋白的表達(dá)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3299738