【背景和目的】單倍體材料作為轉(zhuǎn)化受體具有不受同源染色體聯(lián)會(huì)配對(duì)影響、轉(zhuǎn)化效率較高、外源基因在后代基因組中穩(wěn)定性較好、加倍后即可獲得純合轉(zhuǎn)化植株等優(yōu)點(diǎn),結(jié)合基因編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng),可大大加快煙草品種選育進(jìn)程�！痉椒ā客ㄟ^花粉離體培育獲得單倍體,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯八氫番茄紅素脫氫酶基因位點(diǎn),產(chǎn)生白化單倍體植株�！窘Y(jié)果】（1）經(jīng)過4℃處理4～6天的實(shí)驗(yàn)組,花藥愈傷組織形成率最高可達(dá)11%;（2）獲得轉(zhuǎn)化后單倍體植株120株,其中白化86株（白化率71.67%）,紅花大金元51株,其中白化24株（白化率47.06%）。【結(jié)論】（1）適當(dāng)?shù)蜏靥幚砜商岣呋ㄋ幣嘤龁伪扼w效率;（2）以單倍體為受體的基因編輯效率有所提高。 

【文章來源】：中國煙草學(xué)報(bào). 2020,26(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

PDS基因編輯質(zhì)粒圖譜

取第5片真葉觀察下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)，葉綠體數(shù)分界以15和26為臨界指標(biāo)，葉綠體數(shù)少于15的為單倍體，多于15而少于26的為四倍體。碘液染色后鑒別結(jié)果如圖2 E-F所示，分別為單倍體和四倍體第5片真葉下表皮保衛(wèi)細(xì)胞。單倍體（圖2 E）絕大部分氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)在7～13，四倍體（圖2 F）的葉綠體數(shù)絕大部分在14～23。并且可以看出，單倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞形狀近圓，較四倍體小。2.2 單倍體PDS基因編輯遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

圖3 單倍體轉(zhuǎn)化植株及分子檢測(cè)結(jié)果在煙草育種工作中，育種目標(biāo)是獲得具有目的性狀的純合體。單倍體的染色體數(shù)是正常體細(xì)胞染色體數(shù)的1/2，理論上在單倍體中基因位點(diǎn)被編輯成功的概率更高，且編輯成功的單倍體加倍后獲得的雙單倍體即為純合體，但煙草是異源四倍體，含四套染色體組，單倍體也含兩套染色體組，故在T0代中仍會(huì)出現(xiàn)雜合情況，需要進(jìn)一步篩選單倍體T0代中的位點(diǎn)純合編輯體。本研究利用PDS基因在編輯后產(chǎn)生白化植株作為編輯成功的可視化標(biāo)志，故在T0代白化植株中隨機(jī)選擇各10株進(jìn)行編輯靶點(diǎn)分子檢測(cè)，結(jié)果顯示10株單倍體白化植株中8株為編輯位點(diǎn)純合，10株紅花大金元（四倍體）白化植株中4株為編輯位點(diǎn)純合，可見單倍體白化植株中編輯位點(diǎn)純合的概率較四倍體更高。并且在經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)后，獲得的T0代植株中，單倍體出現(xiàn)白化苗的概率（71.67%）也較紅花大金元出現(xiàn)白化苗的概率（47.06%）高。作為對(duì)照組的紅花大金元T0代白化植株中出現(xiàn)嵌合體，而在單倍體實(shí)驗(yàn)組中沒有出現(xiàn)嵌合體。在T0代白化植株中，位點(diǎn)純合和雜合編輯體在表型上并無明顯差異，還需輔助分子檢測(cè)等手段篩選純合編輯植株。在T0代綠色植株中，可能存在編輯但無性狀的情況（可能只編輯了一條染色體），需要分子檢測(cè)或者自交后確認(rèn)，但本實(shí)驗(yàn)旨在T0代即可篩選出編輯成功的位點(diǎn)純合編輯單倍體，故對(duì)該部分實(shí)驗(yàn)材料未進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。這顯示了單倍體作為受體材料的優(yōu)勢(shì)，單倍體細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生的任何變化都可以通過染色體加倍一次性純合[27]。傳統(tǒng)育種獲得純合穩(wěn)定品系需要連續(xù)7代自交和選擇，且無法實(shí)現(xiàn)所有性狀的絕對(duì)純合，而雙單倍體技術(shù)只需1～2代即可獲得遺傳上100%純合的品系[28]。以單倍體作為基因編輯受體材料，如再利用單倍體加倍技術(shù)，可使后代迅速純合并穩(wěn)定遺傳。

【參考文獻(xiàn)】：
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