背景:組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Histone-lysine N-methyltransferase 2D（KMT2D）是主要的組蛋白3第4位賴氨酸（Histone 3 lysine4,H3K4）甲基轉(zhuǎn)移酶,在組織中廣泛表達(dá),并且在調(diào)控胚胎發(fā)育、分化和代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。H3K4的甲基化（methylation）作為組蛋白修飾的一種類型,通過結(jié)合在基因的增強子與啟動子區(qū)域激活基因轉(zhuǎn)錄。前期研究報道在小鼠胚胎期敲除Kmt2d基因會導(dǎo)致小鼠心臟發(fā)育不全而死亡。我們團隊的研究發(fā)現(xiàn),在成年小鼠心臟中特異性敲除Kmt2d,進行心梗手術(shù)后梗死面積與對照組相比明顯增加,血管再生能力下降。低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α）是調(diào)控細(xì)胞應(yīng)對低氧狀態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在心肌缺血缺氧條件下,HIF-1α表達(dá)上調(diào),從而調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因的表達(dá),以減少心肌受損。此外,HIF-1α調(diào)控其下游基因表達(dá)存在一定的選擇性,即在不同生理病理條件下對基因有不同程度的調(diào)控。有研究表明,表觀遺傳修飾在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用,包括組蛋白甲基化、乙�；葘IF-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)... 

【文章來源】：南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１心肌缺血２４?ｈ后，ｍｌｌＷ組和ｍｌｌ４－ｃＫＯ組小鼠心肌組織染色??

?第二部分實驗結(jié)果???平，并且觀察蛋白表達(dá)水平與低氧時間點的關(guān)系。因這些蛋白都表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，提取核??蛋白，�。保�?｜�。邕M行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測。ＫＭＴ２Ｄ蛋白分子量較大，經(jīng)過探索采取濃度??為６％的分離膠進行電泳，ＫＭＴ２Ｄ抗體目前市面上未銷售，有戈凱教授實驗室贈送。首先??對其抗體特異性進行檢測，結(jié)果（圖１－３）顯示，ＫＭＴ２Ｄ抗體可用于后續(xù)實驗。結(jié)果如（圖??１－４）所示：組蛋白ＨｉｓｔｏｎｅＨ３作為細(xì)胞核內(nèi)參蛋白，在不同時間點表達(dá)量一致；與常氧組??（Ｏｈ）相比，ＨＩＦ－ｌａ在低氧處理后蛋白量積累，低氧４ｈ時蛋白積累量升高，８ｈ后蛋白積??累量達(dá)到最多，１６ｈ蛋白水平積累下降（圖１－４Ａ）；?Ｐ３００作為ＨＩＦ－１轉(zhuǎn)錄輔助激活劑，我??們觀察到Ｐ３００的蛋白水平在４?ｈ和８?ｈ表達(dá)明顯升高（圖１－４Ｂ）。低氧處理后ＫＭＴ２Ｄ的??蛋白水平隨著低氧時間的增加，表達(dá)量明顯上調(diào)（圖１－４Ｃ）；其催化的Ｈ３Ｋ４ｍｅｌ的蛋白水??平在低氧１６?ｈ明顯增加（圖１－４Ｄ）。??Ｈｙｐｏｘｉａ?０?４?８?１６?２４?（ｈ）??——４６０ＫＤ??圖１－３?ＫＭＴ２Ｄ抗體特異性檢測??Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測ＫＭＴ２Ｄ抗體特異性，整張膜孵ｆｔ抗體，觀察足否有丨丨；特性結(jié)介。Ｈ??的蛋白分子量約為５９３ＫＤ，大分子量蛋白ｍａｒｋｅｒ（ＬＣ５６９９）最上端條帶４６０ＫＤ作為指示標(biāo)志。??２２??

?第二部分實驗結(jié)果???錄水平。??２．１總ＲＮＡ的完整性鑒定??提取細(xì)胞的總ＲＮＡ，對其進行完整性檢測，同一批提取的６個樣本，通過１．５％瓊脂??糖凝膠電泳觀察到２８ｓ條帶的亮度約為１８ｓ的２倍，５ｓ條帶最弱（圖２－１?），證明提取的ＲＮＡ??質(zhì)控合格，可繼續(xù)下一步實驗。??Ｈｙｐｏｘｉａ?０?４?８?１６?２４?２４?（ｈ）??ｋｈ?，／?一、二，??■■■■??＾Ｈ５ｓ??圖２－１?ＲＮＡ的完整性檢測結(jié)果??２．２實時熒光定量ＰＣＲ檢測Ｆｅｇｆ和５？／＞３的ｍＲＮＡ表達(dá)水平??檢測ＨＩＦ－ｌｏｃ下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，本實驗采用ｑＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)檢測ＨＩＦ－ｌａ的下游基因??的ｍＲＮＡ表達(dá)水平。因為在低氧應(yīng)激狀態(tài)下，機體能調(diào)動一系列與血管生成、糖代謝、細(xì)??胞凋亡等生理病理過程相關(guān)基因表達(dá)，本實驗對心肌梗死損傷修復(fù)過程中，促進血管生成??過程發(fā)揮重要作用的血管內(nèi)皮生長因子ＶＥＧＦ以及細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵因子ＢＮＩＰ３進??行檢測。結(jié)果如圖２－２所示，低氧處理不同時間后，設(shè)＃的ｍＲＮＡ表達(dá)水平在低氧４?ｈ后??顯著上調(diào)且隨著低氧時間的延長有逐步上升的趨勢（圖２－２Ａ）；?的ｍＲＮＡ水平在低??氧處理后有明顯升高，且在１６ｈ表達(dá)量最高（圖２－２Ｂ）。??２４??

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3273186