發(fā)布時(shí)間：2021-07-03 09:49

　　細(xì)胞核雄性不育是我國油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一。甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育材料7365系統(tǒng)的育性被認(rèn)為受兩對基因控制,即BnaMs3/Bnams3和Bnams4^a/Bnams4^b/Bnams4^c。前人推測Bnams4^a可能是通過DNA甲基化相關(guān)過程恢復(fù)Bnams4^b導(dǎo)致雄性不育。本研究在前人基礎(chǔ)上,通過對僅在Bnams4^a位點(diǎn)分離的736512AB近等基因系進(jìn)行了全基因組重亞硫酸鹽測序比較分析;通過轉(zhuǎn)化反向重復(fù)表達(dá)載體等實(shí)驗(yàn),對前人提出的sRNA通過RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RNA directed DNA methylation,RdDM）調(diào)控育性的觀點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證;通過BAC的單分子實(shí)時(shí)測序（single molecule real time,SMRT）對與Bnams4^a緊密連鎖的基因進(jìn)行驗(yàn)證與排除;在甘藍(lán)型油菜7365A中進(jìn)行Bnams4^a全長序列的遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證,并對啟動子中的串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行截短分析。本研究... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1 前言
    1.1 植物中DNA甲基化
    1.2 DNA甲基化狀態(tài)的建立、維持與去除
    1.3 DNA甲基化的功能
        1.3.1 啟動子DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控
        1.3.2 Gene body區(qū) DNA甲基化的功能
    1.4 DNA甲基化分析方法
    1.5 DNA甲基化在植物雄性不育中的研究
    1.6 甘藍(lán)型油菜全基因組DNA甲基化研究
    1.7 油菜雄性不育與雜種優(yōu)勢利用
    1.8 S45A雄性不育分子機(jī)理研究進(jìn)展
        1.8.1 Bnms1和Bnms2 的定位與克隆
        1.8.2 S45A育性控制機(jī)理
    1.9 9012A/7365A雄性不育分子機(jī)理研究進(jìn)展
        1.9.1 BnaMs3 的圖位克隆與及其新功能化
        1.9.2 9012A/7365A遺傳模式修正
        1.9.3 Bnams4~b的圖位克隆
        1.9.4 7365A育性控制的分子機(jī)理研究
    1.10 顯性核不育宜3A雄性不育分子機(jī)理研究進(jìn)展
        1.10.1 BnaMs5的定位與克隆
        1.10.2 顯性核不育的育性控制機(jī)理
    1.11 細(xì)胞核不育利用途徑
    1.12 本研究的目的和意義
2 材料和方法
    2.1 油菜材料
    2.2 擬南芥材料
    2.3 菌株與載體
    2.4 全基因DNA甲基化測序與分析
        2.4.1 文庫構(gòu)建與全基因組重亞硫酸鹽測序
        2.4.2 測序質(zhì)量控制
        2.4.3 比對到參考基因組
        2.4.4 差異甲基化區(qū)域(DMR)分析
    2.5 常規(guī)重亞硫酸鹽PCR測序驗(yàn)證
    2.6 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR
    2.7 載體構(gòu)建
        2.7.1 反向重復(fù)載體構(gòu)建
        2.7.2 gDNA超表達(dá)的構(gòu)建
        2.7.3 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
        2.7.4 互補(bǔ)載體構(gòu)建
        2.7.5 啟動子截短載體構(gòu)建
    2.8 簡單粗暴法提取DNA
    2.9 BAC的單分子實(shí)時(shí)測序與拼接
    2.10 花藥醋酸洋紅染色
    2.11 花藥亞歷山大染色
    2.12 甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化
    2.13 擬南芥根外植體遺傳轉(zhuǎn)化
    2.14 擬南芥蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因陽性苗篩選
3 結(jié)果與分析
    3.1 近等基因系表型觀察
    3.2 油菜花蕾全基因組甲基化分析
        3.2.1 油菜花蕾全基因組甲基化圖譜
        3.2.2 差異甲基化位點(diǎn)分析
        3.2.3 差異甲基化基因驗(yàn)證
        3.2.4 育性相關(guān)基因定量PCR驗(yàn)證
    3.3 Bnams4甲基化與表達(dá)分析
    3.4 sRNA區(qū)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
        3.4.1 sRNA超表達(dá)表型分析
        3.4.2 sRNA超表達(dá)DNA甲基化與基因表達(dá)分析
        3.4.3 CRISPR/Cas9編輯sRNA區(qū)結(jié)果
        3.4.4 gDNA超表達(dá)轉(zhuǎn)基因結(jié)果
    3.5 Bnams4~a轉(zhuǎn)化擬南芥結(jié)果
    3.6 BAC的重新測序與驗(yàn)證
        3.6.1 BAC單分子實(shí)時(shí)測序與分析驗(yàn)證
        3.6.2 新發(fā)現(xiàn)的2個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
    3.7 Bnams4~a油菜轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
        3.7.1 Bnams4~a全長轉(zhuǎn)化不育背景油菜
        3.7.2 育性恢復(fù)株中Bnams4 甲基化與表達(dá)分析
    3.8 Bnams4 啟動子tandem repeat初步分析
4 討論
    4.1 油菜花蕾全基因組甲基化圖譜
    4.2 WGBS在鑒定育性相關(guān)基因中的應(yīng)用
    4.3 Bnams4調(diào)控區(qū)的sRNA可能不是育性恢復(fù)的原因
    4.4 Bnams4~a是Bnams4~b的復(fù)等位基因
    4.5 Bnams4~a恢復(fù)育性的可能機(jī)制
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ
    附錄1 油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方
    附錄2 擬南芥根外植體遺傳轉(zhuǎn)化配方
    附錄3 使用SeqMan批量去除載體序列流程
    附錄4 本研究所用BS PCR和q-RT PCR引物
    附錄5 本研究用到的其他引物
        附圖1 19條染色體在三種序列環(huán)境下的DNA甲基化分布
        附圖2 ChrC1上24MB位置處的一個(gè)局部DNA甲基化差異
        附圖3-1 3個(gè)基因的常規(guī)重亞硫酸鹽PCR驗(yàn)證
        附圖3-2 2個(gè)基因的常規(guī)重亞硫酸鹽PCR驗(yàn)證
        附圖4 806 ORF與 BnaA06g31090D氨基酸序列比較
        附圖5 1667 ORF與擬南芥同源基因氨基酸序列比較
        附圖6 油菜CRISPR/Cas9植株T2 代混合測序結(jié)果
附錄Ⅱ:作者簡歷及研究生階段發(fā)表論文成果
    作者簡歷
    文章發(fā)表
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]以新需求為導(dǎo)向的油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略[J]. 王漢中.  中國油料作物學(xué)報(bào). 2018(05)
[2]基于分子標(biāo)記的油菜隱性核不育7-7365AB遺傳模式探究[J]. 俎峰,夏勝前,頓小玲,周正富,曾芳琴,易斌,文靜,馬朝芝,沈金雄,涂金星,傅廷棟.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(15)
[3]甘藍(lán)型油菜隱性細(xì)胞核雄性不育系9012AB遺傳模式新釋[J]. 董發(fā)明,洪登峰,劉平武,謝彥周,何慶彪,楊光圣.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2010(03)
[4]我國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的歷史回顧與展望[J]. 王漢中.  中國油料作物學(xué)報(bào). 2010(02)
[5]甘藍(lán)型油菜顯性核不育基因及與恢復(fù)基因的等位性分析[J]. 宋來強(qiáng),傅廷棟,楊光圣,涂金星,馬朝芝.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2006(03)
[6]1對復(fù)等位基因控制的油菜（Brassica napus L.）顯性核不育系609AB的遺傳驗(yàn)證[J]. 宋來強(qiáng),傅廷棟,楊光圣,涂金星,馬朝芝.  作物學(xué)報(bào). 2005(07)
[7]甘藍(lán)型油菜隱性上位互作核不育系9012A與6AB和S45AB遺傳對比[J]. 陳鳳祥,胡寶成,代秉勛,候樹敏,李強(qiáng)生,吳新杰,費(fèi)維新,張曼琳.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 1998(03)
[8]甘藍(lán)型油菜核不育材料育性基因的RAPD標(biāo)記[J]. 涂金星,鄭用璉,傅廷棟.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 1997(02)
[9]油菜顯性核不育三系法制種[J]. 李樹林,周志疆,周熙榮.  上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 1995(01)
[10]甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育材料9012A的發(fā)現(xiàn)與初步研究[J]. 陳鳳祥,胡寶成,李強(qiáng)生,張曼琳.  北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 1993(S4)

博士論文
[1]甘藍(lán)型油菜隱性核不育材料7365AB蛋白質(zhì)組差異分析[D]. 秦毛毛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育基因BnMS5的克隆和功能分析[D]. 辛強(qiáng).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]甘藍(lán)型油菜“花葉”基因的精細(xì)定位及其在雜種優(yōu)勢利用中的應(yīng)用[D]. 倪西源.浙江大學(xué) 2014
[4]甘藍(lán)型油菜核不育系7365A恢復(fù)基因克隆和進(jìn)化分析[D]. 頓小玲.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[5]油菜細(xì)胞核雄性不育基因Bnms3的克隆及功能標(biāo)記開發(fā)[D]. 李季.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[6]甘藍(lán)型油菜核不育系9012AB的遺傳模式修正與BnRf位點(diǎn)的物理定位[D]. 董發(fā)明.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[7]甘藍(lán)型油菜隱性核不育分子機(jī)理及相關(guān)基因功能分析[D]. 周正富.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[8]中國油菜生產(chǎn)技術(shù)供需的經(jīng)濟(jì)學(xué)分析[D]. 李爭.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[9]油菜S45AB隱性核不育分子機(jī)理與應(yīng)用研究[D]. 曾芳琴.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[10]甘藍(lán)型油菜隱性核不育恢復(fù)基因BnMS2的精細(xì)定位與候選基因鑒定[D]. 雷紹林.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009

碩士論文
[1]甘藍(lán)型油菜7365恢復(fù)基因BnaMs3作用機(jī)理研究[D]. 郭翔.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]不同作物Tic40對新型嵌合基因Bnams4b功能的影響[D]. 田甜甜.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[3]熱激打破Bnams4b引起的擬南芥雄性不育及其轉(zhuǎn)錄組分析[D]. 樊煜.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[4]甘藍(lán)型油菜隱性細(xì)胞核不育恢復(fù)基因BnMs4的精細(xì)定位及候選區(qū)段確定[D]. 程玲.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[5]甘藍(lán)型油菜隱性上位核不育的分子機(jī)理研究[D]. 朱云.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號：3262348